Aterese ea hajoale: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Setsi sa Litšoantšo tsa Baeloji sa Elektroniki.
Setsi sa karabelo sa ho kotula leseli 1 (RC-LH1) ke karolo ea mantlha ea photosynthetic ea libaktheria tse pherese tsa phototrophic. Re hlahisitse meaho e 'meli ea cryo-electron microscopy ea RC-LH1 complex ho tsoa ho Rhodopseudomonas palustris. Sebopeho sa qeto ea 2.65-Å sa RC-LH114-W complex se na le li-loops tse 14 tsa subunit LH1 tse potileng RC, tse sitisoang ke protheine W, ha complex e se nang protheine-W e le motsoako oa RC o pota-potiloeng ke RC. Sekoahelo sa subunit LH1 se koetsoe ka botlalo. Papiso ea meaho ena e fana ka temohisiso mabapi le matla a quinone mokhoeng oa RC-LH1, ho kenyeletsoa le liphetoho tse sa hlalosoang tsa sebopeho pele ha ho tlama quinone sebakeng sa RC QB, hammoho le sebaka sa libaka tse thusang tsa ho tlama quinone, tse thusang ho li fetisetsa ho RC. Sebopeho se ikhethang sa protheine ea W se thibela ho koaloa ha sekoahelo sa LH1, ka hona se theha mocha oa ho potlakisa phapanyetsano ea quinone/quinolone.
Matla a fanoang ke photosynthesis a ka tšehetsa hoo e ka bang bophelo bohle lefatšeng, 'me a na le bokhoni bo boholo ba theknoloji ea baeloji ea letsatsi. Leha a ntse a khothalletsa photosynthesis ea lefats'e ka bophara, libaktheria tse pherese tsa phototrophic le tsona li bontša mekhoa e fapaneng ea matla le bokhoni ba metabolism. Li ka qoba photosynthesis 'me tsa hola ha libaktheria tse fapaneng lefifing, li ka lokisa naetrojene le carbon dioxide, tsa hlahisa haedrojene, le ho senya metsoako ea monko (1-3). E le ho fana ka matla bakeng sa lits'ebetso tsena, leseli le tlameha ho fetoloa kapele le ka katleho hore e be matla a lik'hemik'hale. Ts'ebetso ena e qala ha antenna e kopanyang leseli e monya leseli 'me e fetisetsa matla a tšoasitsoeng setsing sa karabelo (RC), ka hona e qala karohano ea tjhaja (4 - 7). Yuniti ea motheo ea photosynthesis libaktheriang tse pherese tsa phototrophic e entsoe ka mofuta oa 2 RC, e pota-potiloeng ke light-harvesting complex 1 (LH1), e etsang RC-LH1 core complex. LH1 e thehoa ke letoto la li-heterodimers tse kobehileng tsa αβ, tseo e 'ngoe le e 'ngoe ea tsona e kopanyang chlorophyll tse peli tsa baktheria (BChl) limolek'hule le carotenoid e le 'ngoe kapa tse peli (8-12). Antenna e bonolo ka ho fetisisa ea LH1 e na le li-heterodimer tse 16 kapa tse 17 tsa αβ tse potolohileng RC (9-13) ka sekoting se koetsoeng, empa mefuteng e meng ea mantlha, li-peptide tsa transmembrane li sitisa ho tsoela pele ha LH1 e potolohileng, Ka hona li khothalletsa ho hasana ha quinol/quinone pakeng tsa RC le cytochrome bc1 complex (11, 13-15). Semela se pherese sa phototrophic Rhodopseudomonas (Rps.) ke sebopuoa sa mohlala se ka utloisisang matla le phetiso ea elektrone e tšehetsang photosynthesis. Sebopeho sa pele sa kristale sa Rps. Mohlala oa motsoako oa palustris RC-LH1 ke RC, o pota-potiloeng ke li-loop tse 15 tsa heterodimeric LH1, tse sitisoang ke protheine e sa tsejoeng e bitsoang "Protheine W" (14). Protheine-W hamorao e ile ea tsejoa e le RPA4402, e leng protheine e sa hlalosoang ea 10.5kDa e nang le li-helice tse tharo tsa transmembrane tse boletsoeng esale pele (TMH) (16). Re sisinya ho reha protheine ea W ea liphatsa tsa lefutso ea rpa4402 ho pufW hore e lumellane le lebitso le sebelisoang bakeng sa liphatsa tsa lefutso tse kenyang RC-L, M (pufL, pufM) le LH1α, β (pufA, pufB) subunits. Hoa thahasellisa hore protheine-W e teng feela ho hoo e ka bang 10% ea RC-LH1, e leng se senolang hore Rps. palustris e hlahisa li-complex tse peli tse fapaneng tsa RC-LH1. Mona, re tlaleha libopeho tsa cryo-EM (cryo-EM) tse nang le qeto e phahameng tsa li-complex tse peli tsa mantlha, e 'ngoe e nang le protheine W le 14 αβ heterodimers, e 'ngoe e se nang protheine W le loop e koetsoeng ea 16 Heterodimer LH1. Sebopeho sa rona se emela phetoho ea mohato kutloisisong ea RC-LH1 complex ea Rps. palustris, hobane re hlahlobile palo e ts'oanang ea mofuta o mong le o mong 'me re na le qeto e lekaneng ea ho beha ka ho hlaka peptide e 'ngoe le e 'ngoe le li-pigment tse tlamiloeng le lipids le quinones tse amanang le tsona. Papiso ea meaho ena e bontša hore liprotheine tse tharo tsa TMH-W tse so fumanoeng motswakong ofe kapa ofe oa RC-LH1 ho fihlela joale li hlahisa kanale ea quinone ho potlakisa phapanyetsano ea quinone/quinolone. Libaka tse 'maloa tsa ho tlama lipid le quinone tse bolokiloeng li se li khethollotsoe, 'me re senotse phetoho e ncha ea sebopeho kamora motsoako oa quinone le RC, e ka bang e loketseng bakeng sa photosystem II (PSII) RC ea libopuoa tse nang le oksijene tse nang le phototrophic. Liphuputso tsa rona li fana ka temohisiso e ncha mabapi le kinetics ea ho tlama quinone/quinolone le phapanyetsano motswakong oa mantlha oa RC-LH1 oa libaktheria tse pherese tsa phototrophic.
E le ho nolofatsa thuto e qaqileng ea metsoako e 'meli e fumanoang ho Rps. palustris, re arola RC-LH1 ka 'ngoe ka mekhoa ea biochemical. Motsoako o haellang protheine W (o tsejoang mona e le ΔpufW) o ile oa hloekisoa ho tsoa mofuteng o se nang jini ea pufW (16), 'me motsoako o le mong feela oa RC-LH1 o ka hlahisoa. Motsoako o nang le protheine W o hlahisoa ke mofuteng. Protheine W ea mofuta ona e fetoloa ka tag ea His ea 10x qetellong ea C-terminus ea eona, e le hore motsoako o nang le protheine W o ka kopanngoa ka katleho le protheine W e haellang ka ho thibela tšepe. Motsoako o arotsoe ka katleho (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Jwalo ka ha ho bontshitswe ho Setshwantsho sa 1, di-complex ka bobedi di na le di-sub-unit tse tharo tsa RC (RC-L, RC-M le RC-H) tse pota-potiloeng ke antenna ya LH1. Sebopeho sa 2.80-A sa complex e se nang protheine-W se bontsha di-heterodimer tse 16 tsa αβ, tse etsang sekgoqetsane se kwetsweng sa LH1 se potileng RC ka botlalo, seo ho tloha mona se tla bitswa RC-LH116 complex. Sebopeho sa 2.65Å sa complex e nang le protheine-W se na le LH1 ya di-heterodimer tse 14 e sitisitsweng ke protheine-W, seo ho tloha mona se tla bitswa RC-LH114-W.
(A le B) Setshwantsho sa bokaholimo ba motsoako. (C le D) Di-pigment tse tlamilweng tse hlahisitsweng ka di-rod. (E le F) Di-complex tse bonwang ho tloha hodima cytoplasmic di na le di-peptide le di-subunit tsa LH1 tse emetsweng dikhathuneng, mme di balwa ka ho ya ka watjhe ho tloha karolong ya protheine-W [e tsamaellanang le dinomoro tsa Rba. sphaeroides complex (13)]. Bakeng sa LH1-α, mmala wa karolo ya protheine ke mosehla; bakeng sa LH1-β, mmala wa karolo ya protheine ke o moputsoa; bakeng sa protheine-W, protheine ke e kgubedu; bakeng sa RC-H, ke cyan; bakeng sa RC-L, ke lamunu; bakeng sa RC-M, ke magenta. Di-cofactor di emetswe ke di-rod, botala bo emela BChl le BPh dimolekhule, pherese e emela di-carotenoid, mme mosehla o emela dimolekhule tsa UQ10. (G le H) Pono e hodisitsweng ya karohano ya protheine-W sebakeng se lekanang sa RC-LH114-W complex (G) le RC-LH116 complex (H). Li-cofactor li bontšoa ka mokhoa oa ho tlatsa sebaka, quinone e chelated e bontšoa ka boputsoa. ​​Lekhalo la protheine-W le totobatsoa ke mola o putsoa o nang le matheba ka hare ho (G), 'me masoba a manyane moo quinone/quinolol e hasanang lesale la LH116 a totobatsoa ke mola o motšo o nang le matheba ka hare ho (H).
Setšoantšo sa 1 (A le B) se bontša RC e pota-potiloeng ke lihlopha tse bulehileng kapa tse koetsoeng tsa LH1αβ heterodimers, tseo e 'ngoe le e 'ngoe ea tsona e kopanyang BChl tse peli le carotenoid e le 'ngoe (Setšoantšo sa 1, C le D). Lithuto tse fetileng li bontšitse hore Rps ke motsoako oa LH1. Tseleng ea biosynthetic ea spirulina xanthin, mefuta ena e na le lihlopha tse tsoakiloeng tsa carotenoids (17). Leha ho le joalo, spiropyrroxanthin ke carotenoid e ka sehloohong 'me bongata ba eona boa khotsofatsa. Ka hona, re khethile ho etsa mohlala oa spiroxanthin libakeng tsohle tsa ho tlama tsa LH1. Li-polypeptide tsa alpha le beta ke li-TMH tse le 'ngoe tse nang le libaka tse khutšoane tsa kantle tsa lera (Setšoantšo sa 1, A, B, E, le F). Leha bongata ba masala a 17 ho C-terminus bo sa ka ba bonoa, alpha polypeptide e ile ea khaoloa ho tloha ho Met1 ho ea ho Ala46 li-complexes ka bobeli. β polypeptide e fokotsehile ho tloha ho Gly4 ho ea ho Tyr52 ho RC-LH116, le ho tloha ho Ser5 ho ea ho Tyr52 ho RC-LH114-W. Ha hoa ka ha bonoa bongata ba masala a 3 kapa 4 a N-terminal kapa a 13 a C-terminal (Setšoantšo sa S1). Tlhahlobo ea Mass spectrometry ea motsoako o tsoakiloeng oa RC-LH1 o lokisitsoeng ho tsoa mofuteng oa mofuta oa wild-type e bontšitse hore sebaka se sieo e bile litholoana tsa karohano ea heterologous ea li-peptide tsena (Setšoantšo sa S1 le S2). Sebopeho sa N-terminal sa α-Met1 le sona se bonoe (f). Tlhahlobo e bontšitse hore α-peptide e na le masala a fMet1 ho ea ho Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, 'me β-peptide e na le masala a Ser2 ho ea ho Ala53, a lumellanang hantle le 'mapa oa density ea EM ea mocheso o tlase.
Ho kopanngoa ha α-His29 le β-His36 ho etsa hore li-BChl li shebane; heterodimer ka 'ngoe ea αβ e kopana le baahelani ba eona ho etsa selika-likoe se bulehileng (RC-LH114-W) kapa selika-likoe se koetsoeng (RC-LH116) ho potoloha RC Sehlopha sa pigment se kopantsoeng ke exciton (Setšoantšo sa 1, C le D). Ha ho bapisoa le sehlopha sa 877 nm sa RC-LH114-W, phetoho e khubelu ea ho monya ea 880 nm ea RC-LH116 ke 3 nm (Setšoantšo sa 2A). Leha ho le joalo, spectrum ea dichroism e chitja e batla e tšoana (Setšoantšo sa 2B), e leng se bontšang hore leha ho na le phapang e hlakileng pakeng tsa li-loop tse bulehileng le tse koetsoeng, tikoloho ea lehae ea BChls e tšoana haholo. Ho fetoha ha redshift ea ho monya e ka ba phello ea motsamao o fokotsehileng oa mocheso le botsitso bo eketsehileng selika-likoe se koetsoeng (18, 19), phetoho ea ho kopana ha pigment e bakoang ke selika-likoe se koetsoeng (20, 21), kapa motsoako oa liphello tsena tse peli (11).
(A) Sekhahla sa ho monya mahlaseli a kotsi a Ultraviolet/bonahalang/a haufi le infrared, ao ditlhoro tsa ona di tshwailweng ka mebala ya tsona e tsamaellanang mme di ntlafaditswe ho fihlela tlhorong ya BPh ho 775 nm. (B) Sekhahla sa dichroism se chitja se ntlafaditswe ho fihlela ho monya ha BChl ho 805 nm. (C le D) Di-spectra tsa ΔA tse kgethilweng ho tswa ho di-spectra tsa ho monya tse rarollotsweng ka nako tsa RC-LH114-W complex (C) le RC-LH116 complex (D). Bakeng sa ho bapiswa hamolemo, di-spectra tsohle di ntlafaditswe ho fihlela ho ∆A ya −A ho 0.2 ps. (E) Sekgahla sa oxidation ya cytochrome c2 kamora ho boneswa ha mahlasedi boteng ba mahloriso a fapaneng a UQ2 (sheba Setshwantsho S8 bakeng sa data e tala). (F) Diseleng tse hodisitsweng tlasa lesedi le tlase, le mahareng kapa le matla a hodimo (10, 30 kapa 300μMm-2 s-1, ka ho latellana), di-subunit tsa protheine W le RC-L ka hara complex e hlwekisitsweng le karolelano ya lera le arohaneng. Fumana boemo ba protheine ka SDS-polyacrylamide gel electrophoresis le immunoassay (sheba Setšoantšo sa S9 bakeng sa lintlha tse tala). Fumana karolelano e amanang le RC-LH114-W complex e hloekisitsoeng. Karolelano ea stoichiometric ea RC-L ho protheine-W ea complex ke 1:1.
Li-BChl tse boemong ba 1 ho loop e senyehileng ea αβ14 ea RC-LH114-W (Setšoantšo sa 1, A, C, le E) li haufi le mofani oa mantlha oa RC (P) ka 6.8Å ho feta li-BChl tse lekanang ho RC-LH116 (Setšoantšo sa 1, B, D, le F, le Setšoantšo sa S3); leha ho le joalo, kinetics ea ho monya ha nakoana ea li-complexes tse peli e bontša hore bakeng sa RC-LH114-W le RC-LH116, li-constant tsa nako ea phetisetso ea matla a ho hlasimolla ho tloha ho LH1 ho ea ho RC ke 40 ±4 le 44±3 ps (Setšoantšo sa 2). , C le D, Setšoantšo sa S4 le Tafole ea S2). Hape ha ho na phapang e kholo phetisetsong ea elektroniki ka har'a RC (Setšoantšo sa S5 le mongolo o tlatsetsang o amanang le ona). Re belaela hore kamano e haufi ea nako ea phetisetso ea matla pakeng tsa LH1 le RC-P e bakoa ke sebaka se tšoanang, sekhutlo le matla a ka bang teng a boholo ba BChl li-loops tse peli tsa LH1. Ho bonahala eka ho hlahloba paterone ea matla a LH1 ho fihlela sebaka se fokolang ha ho potlake ho feta phetiso ea matla a tobileng ho tloha libakeng tse sa lokelang ho ea ho RC. Sekoahelo sa LH1 se bulehileng ho RC-LH114-W se ka boela sa feta motsamaong o sa reng letho oa mocheso tlas'a maemo a mocheso o tlase bakeng sa tlhahlobo ea sebopeho, 'me ho na le sebopeho se selelele sa lesale la αβ14 mochesong oa kamore ho tloha sebakeng sa pigmentation sa βBChls boemong ba RC 1.
Motswako wa RC-LH116 o na le di-BChl tse 32 le di-carotenoid tse 16, mme tlhophiso ya wona ka kakaretso e tshwana le e fumanweng ho Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) le algae e tala (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Kamora ho hokahanya, ho ile ha bonwa diphapang tse nyane feela maemong a di-heterodimers tsa αβ, haholoholo 1-5, 15, le 16 (Setshwantsho S6). Boteng ba protheine-W bo na le tshusumetso e kgolo sebopehong sa LH1. Di-TMH tsa yona tse tharo di hokahantswe ka di-loops tse kgutshwane, ka N-terminal e lehlakoreng la lumen la motswako le C-terminal e lehlakoreng la cytoplasmic (Setshwantsho 1A le 3, A ho isa ho D). Protheine-W e na le hydrophobic haholo (Setšoantšo sa 3B), 'me TMH2 le TMH3 li sebelisana le LH1αβ-14 ho etsa bokaholimo ba transmembrane (Setšoantšo sa 3, B le E ho isa ho G). Sebopeho se entsoe haholo-holo ka masala a Phe, Leu le Val sebakeng sa transmembrane. Masala ana a kopantsoe ka li-amino acid tse sa hlokeng hydrophobic le li-pigment tsa αβ-14. Masala a mang a polar le 'ona a kenya letsoho tšebelisanong, ho kenyeletsoa le tlamo ea haedrojene pakeng tsa W-Thr68 le β-Trp42 holim'a cavity e rarahaneng (Setšoantšo sa 3, F le G). Bokaholimo ba cytoplasm, Gln34 e haufi le sehlopha sa keto sa li-carotenoid tsa αβ-14. Ho phaella moo, molek'hule ea n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) e ile ea rarolloa, 'me mohatla oa eona o sa hlokeng hydrophobic o ile oa atolosoa ho ea ho sebopeho pakeng tsa protheine-W le αβ-14, 'me mohatla oa lipid o ka ba teng' meleng. Re boetse re hlokometse hore libaka tsa qeto ea C-terminal tsa protheine W le RCH li haufi haholo, empa ha li ka har'a sebaka sa ho theha likamano tse itseng (Setšoantšo sa 1, A le E). Leha ho le joalo, ho ka ba le likamano li-amino acid tsa C-terminal tse sa rarolloang tsa liprotheine tsena tse peli, tse ka fanang ka mokhoa oa ho bokella protheine-W nakong ea kopano ea RC-LH114-W complex.
(A) Protheine-W, e shebaneng le sebopeho le LH1αβ14 ka sebopeho sa khathune, e na le ketane e ka thoko e bōpehileng joaloka molamu (e khubelu), e bontšitsoeng karolong ea setšoantšo sa motlakase (bophahamo bo bohlooho bo bonaletsang bo nang le boemo ba contour ba 0.13). (B) Protheine-W e emetsoeng ke bokaholimo bo nang le 'mala o sa tšabeng metsi. Libaka tsa polar le tse chariloeng li bontšoa ka cyan, libaka tse sa tšabeng metsi li bontšoa ka bosoeu, 'me libaka tse sa tšabeng metsi haholo li bontšoa ka lamunu. (C le D) Protheine-W e emetsoeng khathuneng, tataiso ea eona e tšoana le ea (A) (C), 'me e potoloha ka 180° (D). Ho ea ka boemo ba tatellano, masalla a khetholloang a amohela moralo oa 'mala oa mookoli, moo N-terminal e leng putsoa 'me C-terminal e le khubelu. (E) Protheine-W ka pono e tšoanang le ea (A), 'me masalla a sebopehong sa protheine-W:LH1 a emetsoe ke lithupa tse nang le matšoao a khomaretsoeng. (F) Protheine-W e potoloha ka 90° ho latela (E) le LH1αβ14 pontshong ya khathune, mme ho latela masalla a sebopeho pontshong ya bara. Masalla a leketlileng ho tloha ho beta polypeptide a ngotswe. Cofactor e bontshwa e le bara e tsamaellanang le mmala wa Setshwantsho sa 1, β-DDM e bolileng e bontshwa ka bohlooho, mme oksijene e bontshwa ka bofubedu. (G) Pono ho (F) e potoloha ka 180°, ka masalla a hlahelletseng a alpha polypeptide e ngotsweng.
Protheine-W e nkela αβ heterodimer sebaka (ea bo15 ho Setšoantšo sa 1F), ka hona e thibela ho koaloa ha loop le ho sekamisa li-heterodimer tse tharo tsa pele tsa αβ. Ho ile ha hlokomeloa hore sekhutlo se phahameng ka ho fetisisa sa sekamo sa heterodimer ea pele ea αβ-1 mabapi le filimi e tloaelehileng e ne e le 25° ho isa ho 29° (Setšoantšo sa 1, A le E), se ileng sa thehoa ke sekamo sa 2° ho isa ho 8° sa αβ-1 ho RC A sharp contrast-LH116 (Setšoantšo sa 1, B le F). Li-heterodimer tsa bobeli le tsa boraro li sekametse ho 12° ho isa ho 22° le 5° ho isa ho 10°, ka ho latellana. Ka lebaka la tšitiso ea steric ea RC, ho sekamela ha αβ-1 ha ho kenyelletse para ea bobeli ea αβ (e tsamaellanang le αβ ea bo16 ho Setšoantšo sa 1F), kahoo ho etsa lekhalo le hlakileng lesale la LH1 (Setšoantšo sa 1, A le E). Ka lebaka la ho hloka di-heterodimer tse pedi tsa αβ, tse tsamayang le tahlehelo ya di-BChl tse nne le di-carotenoid tse pedi, ha ho le e nngwe ya di-carotenoid e tlamang ho subunit e sothehileng ya αβ-1, e leng se fellang ka lesale la LH114-W le nang le di-carotenoid tse 13 tsa Vegetarian le di-BChl tse 28. Dikhakanyo tsa qeto ya lehae ya di-complex tse pedi dibakeng tsa αβ1 ho isa ho tse 7 di tlase ho feta tsa sekotwana se setseng sa LH1, se ka bontshang plasticity ya tlhaho ya subunit ya LH1 e haufi le sebaka sa RC QB (Setshwantsho sa 4).
Litšoantšo tsa RC-LH114-W (A le B) le RC-LH116 (C le D) li bontšoa ho tsoa ponong e tšoanang e holimo/lehlakoreng (A le B) (A le C) le bokaholimo ba sekoti ba Setšoantšo sa 1. (B le D). Linotlolo tse mebala li bontšitsoe ka ho le letona.
Sebopeho se seng feela sa mantlha se nang le karolelano ea stoichiometric ea 1:14 ke Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Leha ho le joalo, protheine W le PufX ha li na homology e totobetseng, 'me li na le tšusumetso e kholo meahong ea tsona ea LH1. PufX ke TMH e le 'ngoe e nang le sebaka sa cytoplasmic sa N-terminal se sebelisanang le lehlakore la cytoplasmic la subunit ea RC-H (13) boemong bo tsamaellanang le Rps. palustris LH116αβ-16. PufX e theha kanale bakeng sa phapanyetsano ea quinone/quinolone pakeng tsa RC-LH1 le cytochrome bcl complex 'me e teng ho Rba. sphaeroides core complex eohle (13). Leha sebopeho sa monomer-monomer se le ho Rba. Dimer ea sphaeroides RC-LH1-PufX e sebakeng sa ho tlama protheine W ho RC-LH114-W, 'me sekheo se hlahisoang ke PufX le protheine-W se boemong bo lekanang (Setšoantšo sa S7A). Sekheo ho RC-LH114-W se boetse se tsamaisana le kanale ea quinone (8) ea Pseudomonas rosea LH1, e entsoeng ke li-peptide tse sa amaneng le protheine W kapa PufX (Setšoantšo sa S7B). Ho phaella moo, kanale ea quinone ho Blc. LH1 e tala ea emerald e entsoeng ka ho tlosa subunit e le 'ngoe ea γ (7) e sebakeng se tšoanang (Setšoantšo sa S7C). Leha e tsamaisoa ke liprotheine tse fapaneng, ponahalo ea likanale tsena tsa quinone/quinolol boemong bo tšoanang motswakong oa RC-LH1 e bonahala e le mohlala oa phetoho e kopaneng, e bontšang hore sekheo se entsoeng ke protheine W se ka sebetsa e le kanale ea quinone.
Sekgeo se ka hara loop ya LH114-W se dumella ho thehwa ha sebaka se tswelang pele sa lera pakeng tsa sebaka se ka hare sa RC-LH114-W complex le lera le leholo (Setshwantsho sa 1G), ho ena le ho hokahanya dibaka tse pedi ka pore ya protheine jwalo ka diprotheineng. RC-LH116 complex e tshwana le complex e kwetsweng ya Tch. e kang nale (22) (Setshwantsho sa 1H). Kaha ho hasana ha quinone ka hara lera ho potlakile ho feta ho hasana ka tsela e moqotetsane ya protheine, loop e bulehileng ya LH114-W e ka dumella phetoho e potlakileng ya RC ho feta loop e kwetsweng ya LH116, mme ho hasana ha quinone ka hara RC ho ka thibelwa haholoanyane. E le ho leka hore na protheine W e ama phetoho ya quinone ka RC, re entse teko ya cytochrome oxidation hodima mahloriso a itseng a ubiquinone 2 (UQ2) (analogue ya UQ10 ya tlhaho e nang le mohatla o mokgutshwane wa isoprene) (Setshwantsho sa 2E). Leha boteng ba quinone e chelated bo sitisa ho fumana hantle ha constant e bonahalang ya Michaelis (RC-LH114-W le RC-LH116 di loketse 0.2±0.1μM le 0.5±0.2μM, ka ho latellana), sekgahla se phahameng ka ho fetisisa sa RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) se seholo ka 28±5% ho feta RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Qalong re hakantse hore protheine-W e teng hoo e ka bang 10% ea motsoako oa mantlha (16); mona, sekhahla sa ho lula ha lisele tse kholo tse nang le khanya e tlase, khanya e mahareng, le khanya e phahameng ke 15±0.6%, 11±1% le 0.9±0.5, ka ho latellana % (Setšoantšo sa 2F). Papiso ea bongata ea spectrometry ea boima e bontšitse hore ho eketsoa ha tag ea histidine ha hoa ka ha fokotsa bongata ba protheine-W ha ho bapisoa le mefuta ea mofuta oa tlhaho (P = 0.59), kahoo maemo ana ha se ntho ea maiketsetso ea protheine-W e fetotsoeng (Setšoantšo sa S10). Leha ho le joalo, ho lula hona ho tlase ha protheine-W motsoakong oa RC-LH1 ho ka lumella li-RC tse ling ho fetoha ka sekhahla se potlakileng, ka hona ho fokotsa phapanyetsano e liehang ea quinone/quinolone motsoakong oa RC-LH116. Re hlokometse hore sekhahla sa ho lula ha leseli le phahameng ha se lumellane le data ea morao tjena ea transcriptomics, e bontšang hore polelo ea liphatsa tsa lefutso tsa pufW e eketseha tlas'a khanya e matla (Setšoantšo sa S11) (23). Phapang pakeng tsa phetolelo ea pufW le ho kenyelletsoa ha protheine-W ka har'a motsoako oa RC-LH1 e ferekanya 'me e ka' na ea bontša taolo e rarahaneng ea protheine.
Ho RC-LH114-W, limolek'hule tse 6 tsa cardiolipin (CDL), 7 tsa phosphatidylcholine (POPC), 1 ea phosphatidylglycerol (POPG) le 29 tsa β-DDM li abetsoe 'me li entsoe mohlala ho eona, li-CDL tse 6, li-POPC tse 24, li-POPG tse 2 le li-βDDM tse 12. RC-LH116 (Setšoantšo sa 5, A le B). Meahong ena e 'meli, CDL e batla e le ka lehlakoreng la cytoplasmic la motsoako, ha POPC, POPG le β-DDM li fumaneha haholo ka lehlakoreng la luminal. Limolek'hule tse peli tsa lipid le sesepa li ile tsa aroloa sebakeng sa αβ-1 ho isa ho αβ-6 sa motsoako oa RC-LH114-W (Setšoantšo sa 5A), 'me tse hlano li ile tsa aroloa sebakeng se lekanang sa RC-LH116 (Setšoantšo sa 5B). Li-lipid tse ngata li fumanoe ka lehlakoreng le leng la motsoako, haholo-holo CDL, tse bokelletsoeng pakeng tsa RC le αβ-7 ho isa ho αβ-13 (Setšoantšo sa 5, A le B). Li-lipid tse ling tse rarollotsoeng ka sebopeho le li-detergent li fumaneha ka ntle ho lesale la LH1, 'me liketane tsa acyl tse rarollotsoeng hantle li atoloha pakeng tsa li-subunit tsa LH1, tse khethiloeng ka mokhoa oa tentatively e le β-DDM ho RC-LH114-W, 'me li hlalosoa e le β-DDM ho motsoako oa RC A oa β-DDM le POPC-LH116. Maemo a tšoanang a chelating lipids le li-detergent sebopehong sa rona a bontša hore ke libaka tse amanang le 'mele (Setšoantšo sa S12A). Maemo a limolek'hule tse lekanang ho Tch le 'ona a na le botsitso bo botle. Bonolo le Trv. Mofuta oa 970 RC-LH1s (Setšoantšo sa S12, B ho isa ho E) (9, 12) le masala a haedrojene-bonding a sehlopha sa hlooho ea lipid li bontšitse paballo e ntle haholo ho latela tatellano (Setšoantšo sa S13), e leng se bontšang hore Conserved CDL e tlamang ho RC (24), libaka tsena li ka bolokoa moqomong oa RC-LH1.
(A le B) Li-peptide tsa RC-LH114-W (A) le RC-LH116 (B) li emetsoe ke li-cartoon, 'me mebala e emetsoe ke lithupa, ho sebelisoa moralo oa 'mala o ho Setšoantšo sa 1. Lipids li bontšoa ka bofubelu, 'me sesepa se bontšoa ka bohlooho. UQ e tlameletsoeng libakeng tsa RC QA le QB e mosehla, ha UQ e arohaneng e le putsoa. ​​(C le D) Maikutlo a tšoanang le (A) le (B), ka mafura a siiloeng. (E ho isa ho G) Pono e atolositsoeng ea Q1(E), Q2(F) le Q3(G) ho tsoa ho RC-LH116, ka liketane tse lehlakoreng tse susumetsanang. Litlamo tsa haeterojene li bontšoa e le mela e metšo e nang le matheba.
Ho RC-LH116, RC QA le QB UQ ka bobeli, tse nkang karolo phetisong ea lielektrone ts'ebetsong ea karohano ea tjhaja, lia bola libakeng tsa tsona tsa ho tlama. Leha ho le joalo, ho RC-LH114-W, quinone ea QB ha e so rarolloe 'me ho tla tšohloa ka botlalo ka tlase. Ntle le li-quinone tsa QA le QB, limolek'hule tse peli tsa UQ tse chelated (tse pakeng tsa mehele ea RC le LH1) li abetsoe ka sebopeho sa RC-LH114-W ho latela lihlopha tsa tsona tsa hlooho tse rarollotsoeng hantle (tse fumanehang ho Q1 le Q2, ka ho latellana). Setšoantšo sa 5C). Liyuniti tse peli tsa isoprene li abetsoe ho Q1, 'me' mapa oa density o rarolla mehatla e 10 e felletseng ea isoprene ea Q2. Sebopehong sa RC-LH116, limolek'hule tse tharo tsa chelated UQ10 (Q1 ho isa ho Q3, Setšoantšo sa 5D) li rarollotsoe, 'me limolek'hule tsohle li na le density e hlakileng ho pholletsa le mohatla (Setšoantšo sa 5, D ho isa ho G). Meahong ena e 'meli, maemo a lihlopha tsa hlooho ea quinone tsa Q1 le Q2 a na le botsitso bo botle (Setšoantšo sa S12F), 'me a sebelisana feela le RC. Q1 e fumaneha monyako oa sekheo sa W sa RC-LH114-W (Setšoantšo sa 1G le 5, C, D le E), 'me Q2 e haufi le sebaka sa ho tlama sa QB (Setšoantšo sa 5, C, D) le F). Masalla a L-Trp143 le L-Trp269 a bolokiloeng a haufi haholo le Q1 le Q2 'me a fana ka likamano tse ka bang teng tsa π-stacking (Setšoantšo sa 5, E le F, le Setšoantšo sa S12). L-Gln88, 3.0 Å ho tloha oksijeneng e ka thoko ea Q1, e fana ka tlamo e matla ea haedrojene (Setšoantšo sa 5E); masalla ana a bolokiloe ho li-RC tsohle ntle le kamano e hole haholo (Setšoantšo sa S13). L-Ser91 e nkeloa sebaka ke Thr ka mokhoa o bolokang tlhokomelo ho li-RC tse ling tse ngata (Setšoantšo sa S13), ke li-Angstrom tse 3.8 tse tsoang oksijeneng ea methyl ea Q1, 'me li ka fana ka litlamo tse fokolang tsa haedrojene (Setšoantšo sa 5E). Q3 ha e bonahale e na le tšebelisano e itseng, empa e fumaneha sebakeng sa hydrophobic pakeng tsa subunit ea RC-M le subunit ea LH1-α 5 ho isa ho 6 (Setšoantšo sa 5, D le G). Q1, Q2 le Q3 kapa li-quinone tse haufi tse chelated le tsona li rarollotsoe ho Tch. Gentle, Trv. Strain 970 le Blc. Sebopeho sa iris (9, 10, 12) se supa sebaka sa ho tlama quinone se thusang se bolokiloeng moqomong oa RC-LH1 (Setšoantšo sa S12G). Li-UQ tse hlano tse bolileng ho RC-LH116 li lumellana hantle le 5.8±0.7 ea motsoako o mong le o mong o khethiloeng ke chromatography ea metsi e sebetsang hantle (HPLC), ha li-UQ tse tharo tse bolileng ho RC-LH114-W li le tlase ho feta Boleng bo lekantsoeng ba 6.2±0.3 (Setšoantšo sa S14) bo bontša hore ho na le limolek'hule tsa UQ tse sa rarolloang sebopehong.
Li-polypeptide tsa L le M tse sa lekanang ka tsela e itseng ka 'ngoe li na le li-TMH tse hlano 'me li etsa heterodimer e kopanyang dimer e le' ngoe ea BChl, li-monomer tse peli tsa BChl, li-monomer tse peli tsa bacteriophage (BPh), le tšepe e le 'ngoe e seng ea Heme le limolek'hule tse le 'ngoe kapa tse peli tsa UQ10. Ka boteng ba litlamo tsa haedrojene sehlopheng sa ketone sa terminal le pokello ea eona e tsejoang ho Rps, li-carotenoid li kenyelletsoa ho M-subunit, e bitsoang cis-3,4-dehydroorhodopin. Mefuta (25). Sebaka sa kantle sa membrane sa RC-H se khomaretsoe ho membrane ke TMH e le 'ngoe. Sebopeho sa RC ka kakaretso se tšoana le li-subunit tse tharo tsa RC tsa mefuta e amanang (joalo ka Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Li-macrocycle tsa BChl le BPh, mokokotlo oa carotenoid le tšepe e seng ea heme lia kopana ka har'a mefuta ea qeto ea meaho ena, joalo ka sehlopha sa hlooho sa UQ10 sebakeng sa QA le quinone ea QB ho RC-LH116 (Setšoantšo sa S15).
Ho fumaneha ha meaho e 'meli ea RC e nang le sekhahla se fapaneng sa ho lula sebakeng sa QB ho fana ka monyetla o mocha oa ho hlahloba liphetoho tse tsitsitseng tsa sebopeho tse tsamaeang le ho tlama ha quinone ea QB. Moqomong oa RC-LH116, quinone ea QB e sebakeng se tlamiloeng ka botlalo sa "proximal" (26), empa karohano ea RC-LH114-W ha e na quinone ea QB. Ha ho na quinone ea QB ho RC-LH114-W, e leng se makatsang hobane moqomong ona o sebetsa, ho feta moqomong oa RC-LH116 o nang le quinone ea QB e rarollotsoeng ka sebopeho. Le hoja mehele e 'meli ea LH1 e chelate hoo e ka bang li-quinone tse tšeletseng, tse hlano li rarollotsoe ka sebopeho ka har'a lesale la RC-LH116 le koetsoeng, ha tse tharo feela li lekanyelitsoe ka sebopeho ka har'a lesale la RC-LH114-W le bulehileng. Pherekano ena e eketsehileng ea sebopeho e ka 'na ea bontša ho nkeloa sebaka ha libaka tsa QB tsa RC-LH114-W ka potlako, kinetics ea quinone ka potlako moqomong, le monyetla o eketsehileng oa ho tšela loop ea LH1. Re fana ka maikutlo a hore khaello ea UQ sebakeng sa RC QB sa RC-LH114-W e ka ba phello ea motsoako o rarahaneng le o sebetsang haholoanyane, 'me sebaka sa QB sa RC-LH114-W se hoamme hang-hang phetohong ea UQ. Mokhahlelo o ikhethileng (monyako oa sebaka sa QB o koetsoe) o bonts'a sebopeho sa mosebetsi ona.
Ntle le QB, ho potoloha ho tsamaeang ha L-Phe217 ho ea boemong bo sa lumellaneng le ho tlama ha UQ10, hobane ho tla baka ho thulana ha sebaka le yuniti ea pele ea isoprene ea mohatla (Setšoantšo sa 6A). Ho phaella moo, liphetoho tse totobetseng tsa sebopeho sa mantlha li totobetse, haholo-holo helix de (helix e khutšoanyane ka har'a selika-likoe pakeng tsa TMH D le E) moo L-Phe217 e fetisetsoang pokothong ea ho tlama ea QB le ho potoloha ha L-Tyr223 (Setšoantšo sa 6A) Ho roba tlamo ea haedrojene le moralo oa M-Asp45 le ho koala monyako oa sebaka sa ho tlama sa QB (Setšoantšo sa 6B). Helix de pivots botlaaseng ba eona, Cα ea L-Ser209 e fetoloa ka 0.33Å, ha L-Val221Cα e fetoloa ka 3.52Å. Ha ho na liphetoho tse bonahalang ho TMH D le E, tse ka fetoloang ka har'a meaho ka bobeli (Setšoantšo sa 6A). Ho ea kamoo re tsebang kateng, ena ke sebopeho sa pele ho RC ea tlhaho se koalang sebaka sa QB. Papiso le sebopeho se felletseng (se tlamiloeng ke QB) se bontša hore pele quinone e fokotseha, ho hlokahala phetoho ea sebopeho ho etsa hore e kene quinone. L-Phe217 e potoloha ho theha tšebelisano ea π-stacking le sehlopha sa hlooho ea quinone, 'me helix e suthela ka ntle, e lumellang masapo a L-Gly222 le ketane e ka thoko ea L-Tyr223 ho theha marang-rang a tlamo ea haedrojene ka sebopeho se tsitsitseng sa tlamo ea haedrojene (Setšoantšo sa 6, A le C).
(A) Setšoantšo se tšoanang sa hologram (ketane ea L, ketane ea lamunu/M, magenta) le sebopeho sa apo (bohlooho), moo masala a bohlokoa a bontšoang ka mokhoa oa setšoantšo se kang thupa. UQ10 e emetsoe ke bare e mosehla. Mola o nang le matheba o bontša litlamo tsa haedrojene tse entsoeng ka har'a sebopeho sohle. (B le C) Setšoantšo sa bokaholimo ba apolipoprotein le sebopeho sohle sa lesale, se totobatsang oksijene ea ketane ea lehlakore ea L-Phe217 ka boputsoa le L-Tyr223 ka bofubelu, ka ho latellana. Karoloana ea L ke lamunu; likaroloana tsa M le H ha li na 'mala. (D le E) Apolipoprotein (D) le libaka tsohle tsa RC QB ['mala ka (A) ka ho latellana] le Thermophilus thermophilus PSII (e tala, e putsoa ka quinone ea polasetiki; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Ka mokhoa o sa lebelloang, leha ho na le dibopeho tse mmalwa tsa di-RC tse haellang QB tse se nang LH1 tse fumanehang, diphetoho tsa sebopeho tse bonoeng thutong ena ha di so tlalehwe pele. Tsena di kenyeletsa sebopeho sa ho fela ha QB ho tswa ho Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) le Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tseo kaofela di batlang di tshwana le sebopeho sa tsona sa QB ka kakaretso. Tlhahlobo e haufi ya 3PRC e senotse hore dimolek'hule tsa sesepa tsa LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) di tlama monyako wa boemo ba QB, e leng se ka thibelang ho hlophiswa botjha hore e be sebopeho se kwetsweng. Le hoja LDAO e sa bole boemong bo tshwanang ho 1EYS kapa 1OGV, di-RC tsena di lokiswa ho sebediswa sesepa se tshwanang mme ka hona di ka hlahisa phello e tshwanang. Sebopeho sa kristale sa Rba. Sphaeroides RC e kopantsoeng le cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) le yona e bonahala e na le sebaka sa QB se koetsoeng. Leha ho le jwalo, tabeng ena, sebaka sa N-terminal sa polypeptide ya RC-M (se sebelisanang le sebaka sa ho tlama sa QB ka tlamo ya H ya masala a Tyr ho Q helix) se amohela sebopeho se sa tlwaelehang, mme phetoho ya sebopeho sa QB ha e so hlahlojwe ka ho eketsehileng (30). Se kgothatsang ke hore ha re so bone mofuta ona wa phetoho ya polypeptide ya M sebopehong sa RC-LH114-W, e batlang e tshwana le sebaka sa N-terminal sa RC-LH116 RC. Ho lokela ho hlokomelwa hape hore kamora ho fediswa ha antenna ya LH1 e thehilweng hodima sesepa, di-RC tsa apolipoprotein ho PDB di ile tsa rarollwa, tse ileng tsa fedisa matamo a ka hare a quinone le lipids sekgeong se pakeng tsa RC le bokahodimo ba kahare ba lesale le potileng la LH1 (31, 32). RC e ntse e sebetsa hobane e boloka di-cofactor tsohle, ntle le quinone ya QB e bolang, e sa tsitsang haholo mme hangata e lahleha nakong ya tshebetso ya ho lokisa (33). Ho feta moo, ho a tsebahala hore ho tloswa ha LH1 le di-lipid tsa cyclic tsa tlhaho ho RC ho ka ba le tshusumetso mesebetsing, jwalo ka nako e kgutshwanyane ya bophelo ba P+QB-state e arohaneng le tjhaja (31, 34, 35). Ka hona, re nahana hore boteng ba lesale la LH1 la lehae le potileng RC bo ka boloka sebaka sa QB se "koetsweng", ka hona ho boloka tikoloho ya lehae haufi le QB.
Leha apolipoprotein (ntle le QB quinone) le sebopeho se felletseng di emela ditshwantsho tse pedi feela tsa phetoho ya sebaka sa QB, ho ena le letoto la diketsahalo, ho na le matshwao a hore ho tlama ho ka kwalwa ho thibela ho tlama hape ka hydroquinone Ho thibela thibelo ya substrate. Tshebedisano ya quinolol le quinone haufi le sebaka sa QB sa apolipoprotein e ka fapana, e leng se lebisang ho hanelong ha yona ke RC. Ho se ho ntse ho sisintswe nako e telele hore diphetoho tsa sebopeho di bapala karolo ho tlameng le phokotsong ya quinones. Bokgoni ba RCs tse hoammeng ba ho fokotsa quinones kamora ho feto-fetoha ha lefifi bo fokodiswa (36); X-ray crystallography e bontsha hore tshenyo ena e bakwa ke quinones tsa QB tse tshwasehileng sebopehong sa "distal" hoo e ka bang 4.5 Å ho tloha boemong bo sebetsang ba proximal (26), 37). Re fana ka maikutlo a hore sebopeho sena sa ho tlama se distal ke setshwantsho sa boemo bo mahareng pakeng tsa apolipoprotein le sebopeho sa lesale le felletseng, se latelang tshebedisano ya pele le quinone le ho buleha ha sebaka sa QB.
Mofuta oa II RC o fumanoang motswakong oa PSII oa libaktheria tse itseng tsa phototrophic le cyanobacteria, bolele le limela o na le paballo ea sebopeho le ts'ebetso (38). Ho lumellana ha sebopeho ho bontšitsoeng ho Setšoantšo sa 6 (D le E) ho totobatsa ho tšoana pakeng tsa PSII RCs le sebaka sa QB sa motswako oa RC oa baktheria. Papiso ena e bile mohlala oa ho ithuta litsamaiso tse amanang haufi-ufi tsa ho tlama le ho fokotsa quinone. Lingoliloeng tse fetileng li ile tsa fana ka maikutlo a hore liphetoho tsa sebopeho li tsamaea le phokotso ea PSII ea quinones (39, 40). Ka hona, ha ho nahanoa ka paballo ea phetoho ea RC, mokhoa ona oa ho tlama o neng o sa bonoe pele o ka boela oa sebetsa sebakeng sa QB sa PSII RC limela tsa phototrophic tse nang le oksijene.
Rps ΔpufW (ho tlosoa ha pufW ho sa ngolwang) le PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W e hlahisitsoeng ho tsoa mefuteng ea tlhaho ea pufW locus). CGA009 ea palustris e hlalositsoe mosebetsing oa rona o fetileng (16). Mefuteng ena le motsoali oa mofuta oa isogenic wild-type li ile tsa fumanoa sehatsetsing ka ho ntsha palo e nyane ea lisele ho PYE (lithara e 'ngoe le e 'ngoe ea 5 g -1) (e bolokiloeng ho LB ho -80 °C, e nang le protheine ea 50% (w/v) glycerol), tomoso e ntšitsoeng le succinate) agar [1.5% (w/v)]. Poleiti e ile ea beoa bosiu lefifing mochesong oa kamore tlas'a maemo a anaerobic, ebe e bonesoa ka leseli le lesoeu (~50 μmolm-2 s-1) le fanoeng ke OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) matsatsi a 3 ho isa ho a 5 ho fihlela kolone e le 'ngoe e hlaha. Kolone e le 'ngoe e sebelisitsoe ho enta 10 ml ea seaplane sa M22+ (41) e tlatselitsoeng ka 0.1% (w/v) casamino acid (e tla bitsoa M22 ka morao ho moo). Semela sena se holisitsoe tlas'a maemo a tlase a oksijene lefifing ka 34°C ka ho sisinyeha ka 180 rpm ka lihora tse 48, 'me 70 ml ea semelo e ile ea entoa tlas'a maemo a tšoanang ka lihora tse 24. Semela se nang le semi-aerobic se nang le bophahamo ba 1 ml se sebelisetsoa ho enta 30 ml ea seaplane sa M22 ka botlolong ea khalase e bonaletsang ea 30 ml ea screw-top 'me sa khantša ka ho sisinyeha (~50μmolm-2 s-1) ka lihora tse 48 ka matla a makenete a sterile. Molamu o matla oa ho hlohlelletsa o ile oa kenngoa 30 ml ea semelo ka litara e le 'ngoe ea semelo tlas'a maemo a tšoanang, e ileng ea sebelisoa ho enta lilithara tse ka bang 9 tsa semelo tse bonesitsoeng ho ~200 μmolm-2 s-1 ka lihora tse 72. Lisele li kotutsoe ka ho centrifugation ho 7132 RCF metsotso e 30, tsa emisoa hape ka ~10 ml ea 20 mM tris-HCl (pH 8.0), 'me tsa bolokoa ho -20°C ho fihlela ho hlokahala.
Kamora ho qhibiliha, eketsa likristale tse ling tsa deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) le matlapa a mabeli a Roche holoenzyme protease inhibitor (Merck, UK) liseleng tse tsosolositsoeng. Seleng ea khatello ea French ea psi 20,000 (Aminco, USA), lisele li ile tsa sitisoa ka makhetlo a 8 ho isa ho a 12. Kamora ho tlosa lisele tse sa robehang le lithōle tse sa qhibiliheng ka ho centrifugation ho 18,500 RCF metsotso e 15 ho 4°C, lera le ile la ntšoa ho lysate e nang le pigment ka ho centrifugation ho 113,000 RCF ka lihora tse 2 ho 43,000°C. Lahla karolo e qhibilihang 'me u tsosolose lera le mebala ka 100 ho isa ho 200 ml ea 20 mM tris-HCl (pH 8.0) 'me u homogene ho fihlela ho se na li-aggregates tse bonahalang. Lera le leketlileng le ile la beoa ka har'a 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) e nang le 2% (w/v) β-DDM ka hora e le 'ngoe lefifing ho 4°C ka ho hlohlelletsa hanyane. Ebe e kenngoa ka seterifuge ho 70°C ho qhala 150,000 RCF ho 4°C ka hora e le 'ngoe ho tlosa masala a sa qhibiliheng.
Lera le qhibilihang ho tsoa mofuteng oa ΔpufW le ile la sebelisoa kholomong ea phapanyetsano ea li-ion tsa DEAE Sepharose ea 50 ml e nang le li-volume tse tharo tsa kholomo (CV) ea buffer e tlamang [20 mM tris-HCl (pH 8.0) e nang le 0.03% (w / v) β-DDM]. Hlatsoa kholomo ka li-buffer tse peli tsa CV tse tlamang, ebe u hlatsoa kholomo ka li-buffer tse peli tsa tlamang tse nang le 50 mM NaCl. Motsoako oa RC-LH116 o ile oa tlosoa ka gradient e otlolohileng ea 150 ho isa ho 300 mM NaCl (ka har'a buffer e tlamang) ho 1.75 CV, 'me motsoako o setseng oa tlamang o ile oa tlosoa ka buffer e tlamang e nang le 300 mM NaCl ho 0.5 CV. Bokella sekgahla sa ho monya dipakeng tsa 250 le 1000 nm, boloka karolo e nang le karolelano ya ho monya (A880/A280) e fetang 1 ho 880 ho isa ho 280 nm, e hlapolle habeli ka hara buffer e tlamang, mme o sebedise mokhoa o tshwanang hape kholomong ya DEAE On purification. Hlapolla dikarolo tse nang le dikarolwana tsa A880/A280 tse fetang 1.7 le dikarolwana tsa A880/A805 tse fetang 3.0, etsa potoloho ya boraro ya phapanyetsano ya ion, mme o boloke dikarolo tse nang le dikarolwana tsa A880/A280 tse fetang 2.2 le A880/A805 tse fetang 5.0. Motsoako o hloekisitsoeng ka karolo o ile oa kopanngoa ho fihlela ho ~2 ml ka har'a sefe sa Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal (Merck, UK), 'me oa kenngoa kholomong ea ho tlosa ea Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) e nang le 200 mM NaCl buffer, ebe e kenngoa ka har'a buffer e tšoanang ho 1.5 CV. Bokella li-spectra tsa ho monya tsa karolo ea ho tlosa ea boholo, 'me u tsepamise li-spectra tsa ho monya ka li-ratio tsa A880/A280 tse fetang 2.4 le A880/A805 tse fetang 5.8 ho isa ho 100 A880, 'me u li sebelise hang-hang bakeng sa ho lokisa kapa ho boloka gridi ea cryo-TEM Boloka ho -80°C ho fihlela ho hlokahala.
Lera le qhibilihang ho tsoa ho mofuta oa PufW-His le ile la sebelisoa kholomong ea 20 ml ea HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) e nang le 200 mM NaCl le 0.03% (w/w)) ho IMAC buffer (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kholomo e ile ea hlatsuoa ka li-CV tse hlano tsa buffer ea IMAC, 'me ka li-CV tse hlano tsa buffer ea IMAC tse nang le histidine ea 10 mM. Motsoako oa mantlha o ile oa tlosoa kholomong ka li-buffer tse hlano tsa IMAC tse nang le histidine ea 100 mM. Karolo e nang le motsoako oa RC-LH114-W e kopantsoe ho ~10 ml ka tankeng e hlohlellelitsoeng e nang le sefe ea Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), ea tsoakoa ka makhetlo a 20 ka buffer e tlamang, ebe e eketsoa ho 25 ml Kholomong ea DEAE Sepharose, li-CV tse 'ne tse tlameletsoeng ho buffer lia sebelisoa esale pele. Hlatsoa kholomo ka li-buffer tse 'ne tsa ho tlama tsa CV, ebe u ntša motsoako holim'a li-CV tse robeli ka gradient e otlolohileng ea 0 ho isa ho 100 mM NaCl (ka har'a buffer e tlamang), 'me li-CV tse 'ne tse setseng tse nang le buffer e tlamang ea 100 mM. Li-complex tse setseng tse tlamang holim'a sodium chloride li kopantsoe le karolelano ea A880/A280 e phahameng ho feta 2.4 le karolelano ea A880/A805 e phahameng ho feta likaroloana tse 4.6 li ile tsa kopanngoa ho ~2 ml ka har'a sefe ea centrifugal ea Amicon 100,000 MWCO, 'me tsa tlatsoa ka 1.5 CV IMAC ka kholomo ea ho tlosa ea Buffer e lekanang le Superdex 200 16/600, ebe li tsoa ka har'a buffer e tšoanang holim'a 1.5 CV. Bokella di-spectra tsa ho monya tsa dikarolwana tse sa kenyelletsweng boholo mme o tsepamise di-spectra tsa ho monya ka dikarolwana tsa A880/A280 tse fetang 2.1 le A880/A805 tse fetang 4.6 ho isa ho 100 A880, tse sebediswang hang-hang bakeng sa ho lokisa gridi ya TEM e hoammeng kapa tse bolokilweng ho -80°C ho fihlela ho hlokahala.
Sehatsetsi sa ho itima sa Leica EM GP se sebediseditswe ho lokisa digridi tsa TEM tse nang le mocheso o tlase. Motswako o ile wa hlapollwa ka hara buffer ya IMAC ho ya ho A880 ya 50, mme 5μl ya kenngwa hodima letlooeng la koporo le qhibidisitsweng la QUANTIFOIL 1.2/1.3 le kgubedu (Agar Scientific, UK). Kenya gridi ho 20°C le mongobo o lekanang wa 60% metsotso e 30, ebe o e hlakola metsotso e 3, ebe o e tima ka ethane e metsi ho -176°C.
Lintlha tsa RC-LH114-W complex li tlalehiloe ho eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) ka microscope ea Titan Krios, e sebetsang ka motlakase o potlakisang oa 300kV, ka keketseho e tloaelehileng ea 130,000× le matla a- Khetha sekheo sa 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum e nang le detector ea peak ea K2 e sebelisitsoe ho rekota litšoantšo ka mokhoa oa ho bala ho bokella lintlha. Boholo ba pixel bo lekantsoe ke 1.048Å, 'me sekhahla sa tekanyo ke 3.83 e-Å-2s-1. Ke bokelletse filimi ka metsotsoana e 11 'me ka e arola likarolo tse 40. Sebelisa sebaka se koahetsoeng ka carbon ho sheba microscope hape, ebe u bokella lifilimi tse tharo ka lesoba. Ka kakaretso, lifilimi tse 3130 li bokelletsoe, ka boleng ba defocus pakeng tsa -1 le -3μm.
Lintlha tsa RC-LH116 complex li bokelletsoe ho sebelisoa microscope e tšoanang ho Asterbury Biostructure Laboratory (Univesithi ea Leeds, UK). Lintlha li bokelletsoe ka mokhoa oa ho bala ka keketseho ea 130 k, 'me boholo ba pixel bo ile ba lekanngoa ho 1.065 Å ka tekanyo ea 4.6 e-Å-2s-1. Filimi e rekotiloe ka metsotsoana e 12 'me ea aroloa likarolo tse 48. Ka kakaretso, lifilimi tse 3359 li bokelletsoe, ka boleng ba defocus pakeng tsa -1 le -3μm.
Ts'ebetso eohle ea data e etsoa ka har'a phaephe ea Relion 3.0 (42). Sebelisa Motioncorr 2 (43) ho lokisa motsamao oa mahlaseli ka ho lekanya tekanyo, ebe u sebelisa CTTFIND 4.1 (44) ho fumana paramethara ea CTF (mosebetsi oa phetisetso ea phapang). Lifotomicrograph tse tloaelehileng kamora mekhahlelo ena ea pele ea ts'ebetso li bontšitsoe ho Setšoantšo sa 2. S16. Template ea khetho ea othomathike e hlahisoa ka ho khetha ka letsoho li-pixel tse ka bang 250 tsa likaroloana tse 1000 foreiming ea li-pixel tse 250 le sehlopha sa litšupiso tse peli (2D), ka hona ho hana lihlopha tseo tse fihlelang tšilafalo ea sampole kapa tse se nang litšobotsi tse bonahalang. Ebe, khetho ea othomathike e entsoe ho li-microphotograph tsohle, 'me RC-LH114-W e ne e le likaroloana tse 849,359, 'me motsoako oa RC-LH116 e ne e le likaroloana tse 476,547. Likaroloana tsohle tse khethiloeng li fetile mekhahlelong e 'meli ea lihlopha tsa 2D tse sa referenseng, 'me kamora ho matha ka 'ngoe, likaroloana tse kopanang le sebaka sa khabone, tšilafalo ea sampole, ho se nang litšobotsi tse totobetseng kapa likaroloana tse kopaneng ka matla lia haneloa, e leng se fellang ka likaroloana tse 772,033 (90.9%) le 359,678 (75.5%) tse sebelisoang bakeng sa lihlopha tsa 3D tsa RC-LH114-W le RC-LH116 ka ho latellana. Mohlala oa pele oa litšupiso oa 3D o hlahisitsoe ho sebelisoa mokhoa oa ho theoha ha stochastic gradient. U sebelisa mohlala oa pele e le referense, likaroloana tse khethiloeng li arotsoe ka mekhahlelo e mene ho 3D. U sebelisa mohlala sehlopheng sena e le referense, etsa ntlafatso ea 3D holim'a likaroloana tse sehlopheng se seholo ka ho fetisisa, ebe u sebelisa sefe ea pele ea 15Å low-pass ho koahela sebaka sa solvent, eketsa li-pixel tse 6 tsa mathoko a bonolo, 'me u sebetse li-pixels kamora ho lokisa mosebetsi oa phetisetso ea Modulation ea peak Gatan K2 ea detector e holimo. Bakeng sa sete ya data ya RC-LH114-W, mohlala ona wa pele o fetotswe ka ho tlosa bongata bo matla mathōkong a maske (e kgaotsweng ho tloha bongata bo rarahaneng ba mantlha ho UCSF Chimera). Mehlala e hlahisitsweng (diqeto tsa RC-LH114-W le RC-LH116 ke 3.91 le 4.16 Å, ka ho latellana) e sebediswa e le referense bakeng sa potoloho ya bobedi ya sehlopha sa 3D. Dikarolo tse sebedisitsweng di hlophisitswe sehlopheng sa pele sa 3D mme ha di na kamano e matla le tikoloho. Di a kopana kapa ha di na dibopeho tse totobetseng tsa sebopeho. Kamora potoloho ya bobedi ya sehlopha sa 3D, sehlopha se nang le qeto e phahameng ka ho fetisisa se kgethilwe [Bakeng sa RC-LH114-W, sehlopha se le seng ke dikarolo tse 377,703 (44.5%), bakeng sa RC-LH116, ho na le dihlopha tse pedi, tse akaretsang dikarolo tse 260,752 (54.7%), Moo di tshwanang feela ha di lekanyeditswe kamora potoloho ya pele ka phapang e nyane]. Dikaroloana tse kgethilweng di ntshuwa hape ka lebokoseng la dipiksele tse 400 mme di hlwekisitswe ka ho hlwekiswa ha 3D. Maske ya solvent e hlahiswa ho sebediswa sefe sa pele sa 15Å low-pass, katoloso ya mapa ya dipiksele tse 3 le maske e bonolo ya dipiksele tse 3. Ho sebediswa ntlafatso ya CTF ka karolo, tokiso ya motsamao wa karolo le potoloho ya bobedi ya ntlafatso ya CTF ka karolo, ntlafatso ya 3D, masking ya solvent le ho e lokisa kamora mohato o mong le o mong ho ntlafatsa sebopeho se hlahang. Ho sebediswa boleng ba kgaotso ya FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) ya 0.143, diqeto tsa mehlala ya ho qetela ya RC-LH114-W le RC-LH116 ke 2.65 le 2.80Å, ka ho latellana. Sekgahla sa FSC sa mohlala wa ho qetela se bontshitswe ho Setšoantšo sa 2. S17.
Tatellano eohle ea protheine e jarollotsoe ho UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protheine-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) e sebelisitsoe ho haha ​​mohlala oa homology oa RC, o nang le tatellano ea protheine ea RC-L, RC-M le RC-H 'me sebopeho sa kristale sa Rba. sphaeroides RC e sebelisitsoe e le template (PDB ID: 5LSE) (46). Sebelisa sesebelisoa sa "fit map" ho UCSF Chimera ho lekana mohlala o hlahisitsoeng le 'mapa (47), ho ntlafatsa sebopeho sa protheine, le cofactor [4×BChl a (lebitso la masala a laeborari ea monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), mofuta o le mong kapa e 'meli ea UQ10 (U10), e 'ngoe e seng heme iron (Fe) le e 'ngoe ea 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] sebelisa Coot (48) ho eketsa. Kaha QAK ha e fumanehe laeboraring ea monomer, e ile ea aroloa ka paramethara ho sebelisoa sesebelisoa sa eLBOW ho PHENIX (49).
Ka mor'a moo, ho ile ha hahuoa subunit ea LH1. Qalong, sesebelisoa sa kaho se iketsang ho PHENIX (49) se ile sa sebelisoa ho haha ​​karolo ea tatellano ea LH1 ka bohona ho sebelisoa 'mapa le tatellano ea protheine ea LH1-α le LH1-β e le ho kenya. Khetha subunit e felletseng ka ho fetisisa ea LH1, e ntše 'me u e kenye ho Coot, u kenye tatellano e sieo ka letsoho ho eona, 'me u ntlafatse sebopeho sohle ka letsoho pele u eketsa BCls tse peli (BCL) le spirilloxanthin (CRT) [ho latela Rps The density ea motsoako oa LH1 le litaba tse tsebahalang tsa carotenoid. Mefuta (17)]. Kopitsa subunit e felletseng ea LH1, 'me u sebelise UCSF Chimera "Docking Map Tool" ho emisa sebakeng se haufi seo e seng sa mohlala sa density ea LH1, ebe u e ntlafatsa ho Coot; pheta ts'ebetso ho fihlela subunit tsohle tsa LH1 li entsoe mohlala. Bakeng sa sebopeho sa RC-LH114-W, ka ho ntsha bongata bo sa aroloang ho Coot, protheine e aroloa ho tsoa likarolong tse setseng tse seng tsa protheine 'mapeng oa USCF Chimera 'me sesebelisoa sa Autobuild se sebelisoa ho theha mohlala oa pele, le li-subunit tse setseng (protein-W) Modeling. Ho PHENIX (49). Kenya tatellano efe kapa efe e sieo mohlaleng o hlahang ho Coot (48), ebe u ntlafatsa ka letsoho subunit eohle. Bongata bo setseng bo sa aroloang bo lumellana le motsoako oa lipids (ID ea laeborari ea monomer ea PDB ea CDL = CDL, POPC = 6PL le POPG = PGT), sesepa sa β-DDM (LMT) le limolek'hule tsa UQ10 (U10). Sebelisa ntlafatso ea PHENIX (49) le ntlafatso ea letsoho ho Coot (48) ho phethahatsa mohlala o felletseng oa pele ho fihlela lipalo-palo tsa mohlala le boleng ba pono ba ho lekana li ke ke tsa ntlafatsoa le ho feta. Qetellong, sebelisa LocScale (50) ho ntlafatsa 'mapa oa lehae, ebe u etsa lipotoloho tse ling tse' maloa tsa ho etsa mohlala oa bongata bo sa aroloang le ntlafatso ea othomathiki le ea letsoho.
Li-peptide, li-cofactor le li-lipid le li-quinone tse ling tse kentsoeng ka har'a bongata ba tsona li bontšoa ho Setšoantšo sa 1 le sa 2. S18 ho isa ho S23. Tlhahisoleseling ea lipalo-palo ea mohlala oa ho qetela e bontšitsoe ho Tafole ea S1.
Ntle le haeba ho boletsoe ka tsela e 'ngoe, li-spectra tsa ho monya UV/Vis/NIR li bokelletsoe ho Cary60 spectrophotometer (Agilent, USA) ka nako ea 1 nm ho tloha ho 250 nm ho isa ho 1000 nm le nako ea ho kopanya ea 0.1s.
Hlakola sampole ka har'a cuvette ea quartz e nang le tsela ea 2 mm ho ea ho A880 ea 1, 'me u bokelle sepakapaka sa ho monya se pakeng tsa 400 le 1000 nm. Li-spectra tse chitja tsa dichroic li ile tsa bokelloa ho Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Japane) ka mekhahlelo ea 1 nm pakeng tsa 400 nm le 950 nm ka sekhahla sa scan sa 20 nm min-1.
Koefficient ea ho timela ha molar e fumanoa ka ho fokotsa kok'heine ea mantlha ho A880 ea hoo e ka bang 50. Fokotsa bophahamo ba 10μl ho buffer e tlamang ea 990μl kapa methanol, 'me u bokelle sekala sa ho monya hang-hang ho fokotsa ho senyeha ha BChl. Boleng ba BChl ba sampole ka 'ngoe ea methanol bo baliloe ka koefficient ea ho timela ho 771 nm ea 54.8 mM-1 cm-1, 'me koefficient ea ho timela e fumanoe (51). Arola kok'heine ea BChl e lekantsoeng ka 32 (RC-LH114-W) kapa 36 (RC-LH116) ho fumana kok'heine ea kok'heine, e ntan'o sebelisoa ho fumana kok'heine ea ho monya ea sampole e tšoanang e bokelletsoeng ho coefficient ea ho timela ha buffer. parallel. Litekanyo tse tharo tse phetoang li nkuoe bakeng sa sampole ka 'ngoe, 'me karolelano ea ho monya ha BChl Qy maximum e sebelisitsoe bakeng sa lipalo. Koefficient ea ho timela ha RC-LH114-W e lekanngoang ho 878 nm ke 3280±140 mM-1 cm-1, ha koefficient ea ho timela ha RC-LH116 e lekanngoang ho 880 nm e le 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 e lekantsoe ho latela mokhoa o ho (52). Ka bokhutšoanyane, HPLC ea mokhahlelo o ka morao (RP-HPLC) e entsoe ho sebelisoa sistimi ea Agilent 1200 HPLC. Qhibilihisa hoo e ka bang 0.02 nmol ea RC-LH116 kapa RC-LH114-W ka 50μl ea 50:50 methanol:chloroform e nang le 0.02% (w/v) ferric chloride, 'me u ente Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm e lekanang pele. Qhibilihisa ka 1 ml-1 min-1 ho 40°C ka har'a solvent ea HPLC (80:20 methanol:2-propanol) kholomong ea ×25 cm. Etsa isocratic elution ka har'a solvent ea HPLC ho lekola monya ho 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) le 780 nm (BChl) ka hora e le 'ngoe. Sehlohlolo sa chromatogram ea 275 nm ka metsotso e 25.5 se ile sa kopanngoa, se neng se se na metsoako e meng e ka bonoang. Sebaka se kopantsoeng se sebelisetsoa ho bala bongata ba molar ba UQ10 bo ntšitsoeng ho latela lekhalo la calibration le baliloeng ho tsoa ho ente ea litekanyetso tse hloekileng ho tloha ho 0 ho isa ho 5.8 nmol (Setšoantšo sa S14). Sampole ka 'ngoe e hlahlobiloe ka makhetlo a mararo, 'me phoso e tlalehiloeng e tsamaellana le SD ea karolelano.
Tharollo e nang le RC-LH1 complex e nang le ho monya ho hoholo ha Qy ea 0.1 e lokisitsoe ka 30 μM e fokolitsoeng ke horse heart cytochrome c2 (Merck, UK) le 0 ho isa ho 50 μMUQ2 (Merck, UK). Lisampole tse tharo tsa 1-ml li lokisitsoe ho UQ2 concentration ka 'ngoe 'me tsa beoa bosiu bohle lefifing ka 4°C ho netefatsa hore li ikamahanya ka botlalo le lefifi pele ho tekanyo. Tharollo e ile ea kenngoa ka har'a OLIS RSM1000 modular spectrophotometer e nang le grating ea flame/500 line ea 300 nm, inlet ea 1.24 mm, 0.12 mm bohareng le 0.6 mm outlet slits. Sefe ea pass e telele ea 600 nm e beoa monyako oa phototube ea sampole le tube ea reference photomultiplier ho tlosa leseli la ho hlasimolla. Ho monya ho ile ha hlahlojoa ka 550 nm ka nako ea ho kopanya ea 0.15 sns. Leseli la ho hlasimolla le ntšoa ho tsoa ho LED ea 880 nm M880F2 (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) ka thapo ea fiber optic ka matla a 90% ka molaoli oa DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) 'me le ntšoa mohloling oa leseli ka sekhutlo sa 90° ea. Lehlaseli la ho lekanya le khahlanong le seipone ho khutlisa leseli lefe kapa lefe le neng le sa monngoa ke sampole qalong. Lekola ho monngoa ha leseli metsotsoana e 10 pele ho khanya ha leseli la metsotsoana e 50. Ebe ho monngoa ha leseli ho ile ha hlahlojoa hape metsotsoana e 60 lefifing ho lekola hore na quinolol e fokotsa cytochrome c23 + ka boithatelo hakae (sheba Setšoantšo sa S8 bakeng sa data e tala).
Lintlha li sebetsitsoe ka ho kenya sekhahla sa pele sa mola o otlolohileng ka hare ho metsotsoana e 0.5 ho isa ho e 10 (ho latela sekhahla sa UQ2) le ho lekanya sekhahla sa disampole tsohle tse tharo ho sekhahla se seng le se seng sa UQ2. Khatello ea RC-LH1 e baloang ke coefficient ea ho fela e sebelisitsoeng ho fetolela sekhahla hore e be katleho ea catalytic, e thathamisitsoeng ho Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), 'me ea kenngoa mohlaleng oa Michaelis-Menten ho fumana boleng bo bonahalang ba Km le Kcat.
Bakeng sa ditekanyo tsa ho monya ka nakoana, sampole ya RC-LH1 e ile ya hlapollwa ho ya ho ~2μM ka hara buffer ya IMAC e nang le 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) le 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Ascorbic acid e sebediswa e le mofani wa dielektrone wa sehlabelo, mme tert-butaclofen e sebediswa e le thibelo ya QB ho netefatsa hore mofani wa RC ya ka sehloohong o dula a fokotsehile (ke hore, ha a na photooxidized) nakong yohle ya tshebetso ya ho lekanya. Hoo e ka bang 3 ml ya sampole e eketswa sele e potolohang e ikgethileng (e ka bang 0.1 m ka bophara, 350 RPM) e nang le bolelele ba tsela ya optical ya 2 mm ho netefatsa hore sampole tseleng ya laser e na le nako e lekaneng ya ho ikamahanya le lefifi pakeng tsa di-pulse tsa ho hlasimolla. Sebedisa di-pulse tsa laser tsa ~100-fs ho matlafatsa sistimi ya laser ya Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) ho hlasimolla sampole ho 880 nm ka sekgahla sa ho pheta-pheta sa 1 kHz (20 nJ bakeng sa NIR kapa 100 nJ bakeng sa Vis). Pele o bokella data, beha sampole khanyeng e tsosang takatso metsotso e ka bang 30. Ho pepesehela ho tla baka ho se sebetse ha QA (mohlomong ho fokotsa QA hanngoe kapa habeli). Empa ka kopo hlokomela hore ts'ebetso ena e ka fetoloa hobane kamora nako e telele ea ho ikamahanya le lefifi, RC e tla khutlela butle ts'ebetsong ea QA. Spectrometer ea Helios (Ultrafast Systems, USA) e sebelisitsoe ho lekanya li-spectra tse fetohang ka nako ea tieho ea -10 ho isa ho 7000 ps​​. Sebelisa software ea Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) ho arola lihlopha tsa data, ebe u kopanya le ho etsa hore li be maemong a tloaelehileng. Sebelisa sephutheloana sa software ea CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) ho sebelisa sete ea data e kopaneng ho fumana li-spectra tse fapaneng tse amanang le ho bola, kapa sebelisa ts'ebetso e kenyelletsang li-exponents tse ngata ka karabelo ea sesebelisoa ho lekana phetoho ea spectral ea wavelength e le 'ngoe ho Origin (OriginLab, USA).
Jwalo ka ha ho boletswe ka hodimo (53), filimi ya photosynthetic e nang le LH1 complex e se nang RC le peripheral LH2 antenna e ile ya lokiswa. Lera le ile la hlapollwa ka hara 20 mM tris (pH 8.0) mme la kenngwa ka hara quartz cuvette e nang le tsela ya optical ya 2 mm. Ho ile ha sebediswa pulse ya laser ya 30nJ ho tsosa sampole ho 540 nm ka nako ya tieho ya -10 ho isa ho 7000 ps. Sebetsa sete ya data jwalo ka ha ho hlalositswe bakeng sa sampole ya Rps. pal.
Lera le ile la pelletsoa ka ho centrifugation ho 150,000 RCF ka lihora tse 2 ho 4°C, 'me ka mor'a moo monyelo oa lona ho 880 nm oa emisoa hape ho 20 mM tris-HCl (pH 8.0) le 200 mM NaCl. Qhibilihisa lera ka ho hlohlelletsa butle-butle 2% (w/v) β-DDM ka hora e le 'ngoe lefifing ho 4°C. Sampole e ile ea hlapolloa ho 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ho ea ho protein concentration ea 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis). Ts'ebetso e 'ngoe e ile ea etsoa ho latela mokhoa o phatlalalitsoeng pele (54), ho qala ka ho hlapolloa ha protheine ea 50 μg ho ea ho kakaretso ea 50 μl TEAB e nang le 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Kamora ho e metsa metsotso e 60, e ile ea fokotsoa ka 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) ho 37°C metsotso e 30. Bakeng sa S-alkylation, kenya sampole ka 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) 'me u e kenye ho tsoa tharollong ea 200 mM isopropanol stock metsotso e 10 mochesong oa kamore. Tšilo ea proteolytic e entsoe ka ho eketsa 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mix (Promega UK) 'me ea kenngoa mochesong oa 37°C lihora tse 3. Laurate surfactant e ntšoa ka ho eketsa 50 μl ethyl acetate le 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) le ho ntša metsi metsotsoana e 60. Karohano ea mokhahlelo e ile ea ntlafatsoa ka ho centrifugation ho 15,700 RCF metsotso e 5. Ho ea ka protocol ea moetsi, kholomo ea spin ea C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) e ile ea sebelisoa ho hema le ho tlosa letsoai karolong e ka tlase e nang le peptide ka hloko. Kamora ho omisa ka ho centrifugation ka vacuum, sampole e ile ea qhaloa ka 0.5% TFA le 3% acetonitrile, 'me 500 ng e ile ea hlahlojoa ke nanoflow RP chromatography e kopantsoeng le mass spectrometry ho sebelisoa liparamente tsa sistimi tse hlalositsoeng pele.
Sebelisa MaxQuant v.1.5.3.30 (56) bakeng sa ho tsebahatsa protheine le ho lekanya ho batla database ea Rps. palustris proteome (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Lintlha tsa proteomics tsa boima ba spectrometry li kentsoe ho ProteomeXchange Alliance ka polokelo ea balekane ba PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) tlas'a sesupo sa sete ea data PXD020402.
Bakeng sa tlhahlobo ea RPLC e kopantsoeng le electrospray ionization mass spectrometry, RC-LH1 complex e lokisitsoe ho tsoa ho wild-type Rps. Ho sebelisoa mokhoa o phatlalalitsoeng pele (16), mahloriso a protheine a hlahisitsoeng liseleng tsa palustris e ne e le 2 mg ml-1 ho 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl le 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM. Ho ea ka protocol ea moetsi, sebelisa 2D purification kit (GE Healthcare, USA) ho ntša protheine ea 10 μg ka mokhoa oa pula, le ho qhala precipitate ka har'a 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA), 20% (v / v) Acetonitrile le 20% (v/v) metsi. Li-microliter tse hlano li ile tsa hlahlojoa ke RPLC (Dionex RSLC) e kopantsoeng le mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Sebelisa kholomo ea MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) bakeng sa karohano ho 60°C le 100μlmin -1, ka gradient ea 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA le 0.02% (V/v) TFA aqueous solution] ho 85%(v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA le 0.02%(v/v) ho 90%(v/v) acetonitrile TFA] U sebelisa mohlodi o tloaelehileng oa electrospray ionization le liparamente tsa kamehla ka metsotso e fetang 60, spectrometer ea boima e fumana 100 ho isa ho 2750 m/z (boima-ho-tjhaja karolelano). Ka thuso ea portal ea lisebelisoa tsa ExPASy bioinformatics FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), kopanya spectrum ea boima ho li-subunit tsa complex.
Lisele li holisitsoe ka lihora tse 72 tlas'a khanya ea 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), e mahareng (30μMm-2 s-1) kapa e phahameng (300μMm-2 s-1). Sekala sa M22 (sekala sa M22 seo ammonium sulfate e sa sebelisoang ho sona 'me sodium succinate e nkeloa sebaka ke sodium acetate) ka botlolong ea 100 ml screw-top (23). Metsotsong e mehlano ea metsotsoana e 30, lifaha tsa khalase tsa 0.1 micron li ile tsa beoa lifaha ka karolelano ea bophahamo ba 1:1 ho lysa lisele 'me tsa pholisoa leqhoeng metsotso e 5. Lintho tse sa qhibiliheng, lisele tse sa robehang le lifaha tsa khalase li ile tsa tlosoa ka centrifugation ho 16,000 RCF metsotso e 10 ka benchtop microcentrifuge. Lera le ile la aroloa ka rotor ea Ti 70.1 e nang le RCF ea 100,000 ho 20 mM tris-HCl (pH 8.0) e nang le gradient ea sucrose ea 40/15% (w/w) ka lihora tse 10.
Jwalo ka ha ho hlalositswe mosebetsing wa rona o fetileng, ho lemoha tshwao ya His immune tag ho PufW (16). Ka bokhutshwane, complex e hlwekisitsweng ya mantlha (11.8 nM) kapa lera le nang le mahloriso a tshwanang a RC (e fumanweng ke oxidation e tlosang phapang e fokotsehileng le ho bapisa mojaro ho gel e silafaditsweng) ho 2x SDS loading buffer (Merck, UK) e ile ya hlapollwa habeli. Diprotheine di ile tsa arolwa ho gel ya replica ya 12% bis-tris NuPage (Thermo Fisher Scientific, UK). Gel e ile ya tshwauwa ka Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ho kenya le ho bona ka mahlo a RC-L subunit. Protheine e ho gel ya bobedi e ile ya fetisetswa ho membrane ya polyvinylidene fluoride (PVDF) e sebediswang ke methanol (Thermo Fisher Scientific, UK) bakeng sa tlhahlobo ya immunoassay. Lera la PVDF le ile la thijoa ka har'a 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 le 5% (w / v) phofo ea lebese e tlositsoeng, 'me ea kenngoa ka antibody ea mantlha ea anti-His (ho Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl le 0.05% (v/v) Tween-20] ka 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) ka lihora tse 4. Kamora ho hlatswa ka makgetlo a 3 metsotso e 5 ka hara antibody buffer, lera le ile la kopanngwa le horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (e hlapolotsweng ka 1:10,000 ka hara antibody buffer) E futhumatsa ho dumella ho fumanwa (metsotso e 5 kamora ho hlatswa ka makgetlo a 3 ka hara antibody buffer) ho sebediswa WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italy) le Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Ka ho taka kabo ea matla a gel e 'ngoe le e 'ngoe e silafalitsoeng kapa tsela ea immunoassay, ho kopanya sebaka se ka tlas'a tlhoro le ho bala karolelano ea matla a RC-L (gel e silafalitsoeng) le Protheine-W (immunoassay), ho ImageJ (57) Sebetsa setšoantšo. Likarolelano tsena li fetotsoe ho li-molar ratios ka ho nka hore karolelano ea RC-L ho protheine-W sampole e hloekileng ea RC-LH114-W e ne e le 1:1 le ho etsa hore data eohle e be boemong bo tloaelehileng ka ho latela.
Bakeng sa lisebelisoa tse ling bakeng sa sengoloa sena, ka kopo sheba http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ena ke sengoloa se bulehileng se abelwang tlasa dipehelo tsa Laesense ya Creative Commons Attribution. Sengoloa sena se dumella tshebediso e sa thibelwang, kabo, le tlhahiso botjha ka mokgwa ofe kapa ofe tlasa boemo ba hore mosebetsi wa pele o qotsitswe hantle.
Tlhokomeliso: Re kopa feela hore o fane ka aterese ea hau ea lengolo-tsoibila e le hore motho eo u mo khothaletsang leqepheng a tsebe hore u batla hore a bone lengolo-tsoibila le hore ha se spam. Re ke ke ra hapa liaterese life kapa life tsa lengolo-tsoibila.
Potso ena e sebelisetsoa ho leka hore na u moeti le ho thibela ho romelloa ha spam ka bohona.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Sebopeho sa qeto e phahameng sa light trap 1 complex setsing sa karabelo se fana ka temohisiso e ncha mabapi le di-dynamics tsa quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Sebopeho sa qeto e phahameng sa light trap 1 complex setsing sa karabelo se fana ka temohisiso e ncha mabapi le di-dynamics tsa quinone.
©2021 Mokhatlo oa Amerika oa Tsoelo-pele ea Saense. litokelo tsohle li sirelelitsoe. AAAS ke molekane oa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.