Ho hlopha protheine tseleng ea secretory ho bohlokoa bakeng sa ho boloka karohano ea lisele le homeostasis. Ntle le ho hlopha ka khetla, karolo ea lipids ho hlopheng kinesin ts'ebetsong ea ho tsamaisa secretory ke potso ea motheo ea nako e telele e e-so arajoe. Mona, re etsa setšoantšo sa nako ea 'nete sa 3D ka nako e le' ngoe sa mebala e mengata e phahameng ho paka ka har'a 'mele hore liprotheine tse sa tsoa etsoa tsa glycosylphosphatidylinositol tse nang le lipid tse telele haholo tsa ceramide li kopantsoe 'me li arotsoe ka lihlopha tse khethehileng tsa endoplasms. Sebaka sa ho tsoa sa Net, se fapaneng le se sebelisoang ke liprotheine tsa transmembrane. Ho phaella moo, re bontša hore bolelele ba ketane ea ceramide lerabeng la endoplasmic reticulum bo bohlokoa bakeng sa khetho ena ea ho hlopha. Thuto ea rona e fana ka bopaki ba pele bo tobileng ba ka har'a 'mele ba ho arola thepa ea protheine e thehiloeng boleleleng ba ketane ea lipid libakeng tse khethiloeng tsa ho romela kantle ho naha tseleng ea secretory.
Liseleng tsa eukaryotic, liprotheine tse entsoeng ka har'a endoplasmic reticulum (ER) li hlophisoa nakong ea ho tsamaisoa ka tsela ea secretory bakeng sa ho isoa sebakeng sa tsona se loketseng sa sele (1). Ntle le ho hlopha ka coat-mediated, ho ne ho nahanoa ka nako e telele hore li-lipid tse itseng li ka boela tsa sebetsa e le libaka tse khethiloeng tsa ho tsoa ka ho li kopanya libakeng tse itseng tsa membrane ho feta liprotheine tse itseng (2-5). Leha ho le joalo, ho ntse ho e-na le khaello ea bopaki bo tobileng ba in vivo ho paka mokhoa ona o ka khonehang oa lipid-based. E le ho rarolla bothata bona ba mantlha, re ithutile ka tomoso hore na liprotheine tse khomaretsoeng tsa glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) li romelloa ka tsela e fapaneng ho tsoa ho ER. GPI-APs ke mefuta e fapaneng ea liprotheine tse hokahaneng le lipid-surface cell (6, 7). GPI-AP ke protheine e ntšitsoeng e khomaretsoeng lipampitšaneng tse ka ntle tsa plasma membrane ka har'a glycolipid moiety (GPI ankora). Li amohela li-ankora tsa GPI e le liphetoho tse bolokang tsa kamora phetolelo ho ER lumen (8). Kamora ho hokelloa, GPI-AP e feta ka har'a sesebelisoa sa Golgi (5, 9) ho tloha ho ER ho ea lera la plasma. Boteng ba liankora tsa GPI bo etsa hore GPI-AP e tsamaisoe ka thoko ho tsoa liprotheineng tse ntšitsoeng ka transmembrane (ho kenyeletsoa le liprotheine tse ling tsa lera la plasma) tseleng ea secretory (5, 9, 10). Liseleng tsa tomoso, li-GPI-AP li aroloa ho tsoa liprotheineng tse ling tse ntšitsoeng ka har'a endoplasmic reticulum, ebe li kenngoa ka har'a li-vesicles tse ikhethang tse phuthetsoeng ke coat protein complex II (COPII) (6, 7). Lintho tse khethollang ts'ebetso ena ea ho arola ts'ebetsong ea ho romela kantle ho ER ha li hlake, empa ho nahanoa hore mokhoa ona o ka hloka li-lipid, haholo-holo ho nchafatsoa ha sebopeho sa karolo ea lipid ea ankora ea GPI (5, 8). Ho tomoso, ho nchafatsoa ha li-lipid tsa GPI ho qala hang ka mor'a hore GPI e khomarele, 'me maemong a mangata, ho etsa hore ceramide e tlamelle ho 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26: 0) (11, 12). C26 ceramide ke ceramide e ka sehloohong e hlahisoang ke lisele tsa tomoso ho fihlela joale. E entsoe ka har'a ER 'me boholo ba eona bo romeloa ho sesebelisoa sa Golgi ka li-vesicles tsa COPII (13). Ho romelloa ha GPI-AP ho ER ho hloka ka ho khetheha tlhahiso ea ceramide e tsoelang pele (14, 15), 'me ka lehlakoreng le leng, phetoho ea ceramide ho inositol phosphate ceramide (IPC) sesebelisoa sa Golgi e itšetlehile ka tlhahiso ea anchor ea GPI (16). Lithuto tsa biophysical tse nang le lera la maiketsetso li bontšitse hore li-ceramide tse telele haholo tsa acyl chain li ka kopana ho theha libaka tse hlophisitsoeng tse nang le thepa e ikhethang ea 'mele (17, 18). Lintlha tsena li lebisa khopolo-taba ea hore C26 ceramide le GPI-AP tse nang le C26 ceramide li sebelisa thepa ea tsona ea 'mele ho kopana libakeng tse hlophisehileng kapa libakeng tse tikolohong ea lipid ea membrane ea ER e sa tsitsang. E entsoe haholo-holo ka li-glycerolipids tse khutšoane le tse sa koaheloang (C16:1 le C18:1) (19, 20). Libaka tsena li tla shebana ka ho khetheha le libaka tse itseng tsa ho tsoa tsa ER (ERES), moo ceramide le GPI-AP e thehiloeng ho ceramide li ka tsamaisoang hammoho ho ea Golgi ka vesicle e tšoanang ea COPII (5).
Thutong ena, re lekile ka ho toba mokhoa ona o thehiloeng ho lipid ka ho sebelisa microscopy ea confocal real-time imaging microscopy (SCLIM), e leng mokhoa oa morao-rao oa microscopy o ka bonang liprotheine tse ngotsoeng ka fluorescent ka nako e le 'ngoe. Litšoantšo tsa mebala e meraro le tse tharo (3D) li na le qeto le lebelo le phahameng haholo liseleng tse phelang (21, 22).
Re qalile ka ho sebelisa theknoloji ea SCLIM ho hlalosa haholoanyane hore na GPI-AP e tloaelehileng e nang le sehlopha sa ceramide sa C26 e ne e hlahlojoa joang ho tsoa liprotheineng tse nkiloeng ka transmembrane kamora ho tsoa ho ER ho S. cerevisiae. E le ho hlahloba sehlopha sa ER, re sebelisitse sistimi ea liphatsa tsa lefutso e ka bonang ka ho toba thepa e sa tsoa etsoa e kenang ho ERES ka har'a vivo (7, 23). Jwalo ka thepa, re khethile GPI-AP Gas1 e thehiloeng ho C26 ceramide e ngotsoeng ka protheine e tala ea fluorescent (GFP) le protheine e nkiloeng ka transmembrane Mid2 e ngotsoeng ka protheine e haufi le infrared fluorescent (iRFP), tseo ka bobeli li shebaneng le lera la plasma (24-26). Ho mutant e utloang mocheso oa sec31-1, thepa ena e 'meli e hlahisoa tlas'a promoter ea galactose-inducible le lets'oao la ERES le constitutive. Mochesong o feteletseng (37°C), hobane phetoho ea sec31-1 e ama ts'ebetso ea karolo ea COPII coat Sec31 ho thibela ho mela ha COPII le ho romelloa ha ER, thepa e sa tsoa etsoa e bokellana ho ER (23). Kamora ho pholile ho fihlela mochesong o tlase (24°C), lisele tse fetotsoeng tsa sec31-1 li ile tsa hlaphoheloa sebakeng sa secretory, 'me thepa e ncha ea maiketsetso e bokelletsoeng e ile ea qala ho romeloa kantle ho ER. Pono ea CLIM e bontšitse hore boholo ba Gas1-GFP le Mid2-iRFP tse sa tsoa etsoa li ntse li bokelletsoe ho ER ea lisele tse fetotsoeng tsa sec31-1 kamora ho ikatisa ho 37°C ebe li lokolloa ho 24°C metsotso e 5 (Setšoantšo sa 1). Kaha Mid2-iRFP e ajoa holim'a lera lohle la ER, 'me Gas1-GFP e teteane 'me e bokelloa sebakeng sa lera la ER le sa khaotseng, kabo ea tsona e fapane ka ho feletseng (Setšoantšo sa 1, A ho isa ho C le Movie S1). Ho phaella moo, joalo ka ha ho bontšitsoe ho Setšoantšo sa 1D, sehlopha sa Gas1-GFP ha se na Mid2-iRFP. Liphetho tsena li bontša hore liprotheine tsa GPI-AP le transmembrane li ile tsa aroloa libakeng tse fapaneng tsa lera la ER pele ho nako. Sehlopha sa Gas1-GFP se haufi le ERES e itseng e ngotsweng ka protheine ya COPII ya mCherry Sec13 (Setshwantsho sa 1, E le F, le filimi S1) (23).
Lisele tsa sec31-1 li hlahisa li-secretion tse bakoang ke galactose, ketane e telele ea acyl (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, e tala) le protheine ea transmembrane Mid2-iRFP (TMP, e putsoa) 'me lebitso lena la Constructive ERES le bitsoang Sec13-mCherry (ERES, magenta) le ile la beoa mochesong oa 37°C metsotso e 30, la fetisetsoa ho 24°C, 'me la ntšoa ke SCLIM metsotso e 5 hamorao. (A ho isa ho C) e bontša setšoantšo se kopantsoeng kapa se le seng sa 2D sa sefofane (A), setšoantšo sa projekte ea 2D sa likarolo tse 10 tsa z (B) kapa setšoantšo sa hemisphere ea sele ea 3D sa thepa le matšoao a ERES (C). Bar ea sekala 1μm (A le B). Yuniti ea sekala ke 0.551μm (C). Gas1-GFP e fumanoe libakeng tse arohaneng tsa ER kapa lihlopha, ha Mid2-iRFP e fumanoe 'me ea ajoa ho pholletsa le lera la ER (C). (D) Grafo e bonts'a matla a khanya a Gas1-GFP le Mid2-iRFP sehlopheng sa Gas1-GFP ho latela mola o mosweu wa motsu (ka letsohong le letshehadi). AU, yuniti e sa fetoheng. (E le F) di emela setshwantsho sa 3D se kopanyang thepa le letshwao la ERES. Lihlopha tsa Gas1-GFP di ile tsa bonwa haufi le ERES e ikgethang. Yuniti ya sekala ke 0.551μm. (F) Motsu o mosweu o tiileng o tshwaya sehlopha sa Gas1-GFP se amanang le ERES. Diphanele tse bohareng le tse ka ho le letona di bontsha setshwantsho se hodisitsweng sa 3D se kopaneng le pono e potolohang ya sehlopha se kgethilweng sa Gas1-GFP.
Kamano e haufi ea sebaka pakeng tsa sehlopha sa Gas1-GFP le ERES e itseng e bontša hore Gas1-GFP e ka kena ho ERES e khethiloeng, e fapaneng le khetho e sebelisoang ke Mid2-iRFP ho tsoa ho ER. Ho sebetsana le monyetla ona, re lekantse karolelano ea ERES bakeng sa thepa e le 'ngoe kapa tse peli feela (Setšoantšo sa 2, A ho isa ho C). Re fumane hore boholo ba ERES (70%) bo na le mofuta o le mong feela oa thepa. Setšoantšo se ka tlase sa Setšoantšo sa 2C se bontša mehlala e 'meli e tloaelehileng ea ERES e nang le Gas1-GFP feela (Setšoantšo sa 1) kapa Mid2-iRFP feela (Setšoantšo sa 2). Ka lehlakoreng le leng, hoo e ka bang 20% ​​ea ERES e na le thepa e 'meli e kopanang sebakeng se le seng. Ho fumanoe hore tse ling tsa ERES (10%) li na le mefuta e 'meli ea thepa, empa li ne li arotsoe libakeng tse fapaneng ka ho hlaka. Ka hona, tlhahlobo ena ea lipalo-palo e bontša hore ka mor'a hore ER e romelloe kantle ho naha, GPI-AP Gas1-GFP le thepa ea transmembrane Mid2-iRFP li arotsoe ka ERES tse fapaneng (Setšoantšo sa 2D). Bokgoni bona ba ho hlopha bo tsamaellana haholo le tlhahlobo ya dikhemikhale ya pele (6) le qeto ya sebopeho (7). Re ka boela ra bona boitshwaro ba thepa e qadileng e kenang ERES (Setshwantsho sa 2E le Movie S2). Setshwantsho sa 2E se bontsha hore karolo e nyane feela ya Gas1-GFP (phanele ya 3) kapa Mid2-iRFP (phanele ya 4) e kenang ERES ho tloha lehlakoreng le leng mme e kwalletswe sebakeng se arohaneng. Phanele ya 5 ya Setshwantsho sa 2E e bontsha hore Gas1-GFP le Mid2-iRFP ka dinako tse ding di fumanwa ho ERES e tshwanang, empa di kena ka mahlakoreng a fapaneng mme di kopane dibakeng tse arohaneng tse ka emelang di-vesicle tse fapaneng tsa COPII. Re boetse re tiisitse hore karohano e bonoeng le ho hlophiswa ha GPI-AP Gas1 e thehilweng ho C26 ceramide e le ERES e kgethilweng e ikgethile hobane thepa e nngwe ya transmembrane secretion, protheine ya plasma membrane e nang le tag ya GFP Axl2 (27), e bontshang boitshwaro bo tshwanang le ba Mid2-iRFP. (Setshwantsho sa S1 le Movie S3). Axl2-GFP e sa tsoa kopanngoa e ajoa ka lera la ER joalo ka Mid2-iRFP (Setšoantšo sa S1, A le B), 'me e kopantsoe le Mid2-iRFP ho boholo ba ERES (Setšoantšo sa S1, B ho isa ho D). Liphanele tsa 1 le tsa 2 tsa Setšoantšo sa 1. S1C e bontša mehlala e 'meli e tloaelehileng ea ERES moo thepa e 'meli ea transmembrane e kopanang. Maemong ana, thepa ka bobeli e kena ERES hammoho (Setšoantšo sa S1E, Panel ea 3 le Movie S3).
Lisele tsa sec31-1 tse hlahisang di-secretion tse ka hlahiswang ke galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, e tala) le Mid2-iRFP (TMP, e putsoa) le tse nang le lebitso la ERES tse nang le Sec13-mCherry (ERES, magenta) di ile tsa bewa ho 37 Kamora ho futhumala metsotso e 30 ho °C, fetela ho 24 °C ho lokolla secretion block, le setshwantsho ka SCLIM kamora metsotso e 20. (A ho isa ho C) Ditshwantsho tse emelang tsa 2D projekshene (A; scale bar, 1μm) kapa ditshwantsho tsa hemisphere ya sele ya 3D (B le C; scale unit, 0.456μm) ya thepa le dikarolo tse 10 tsa z tse tshwailweng ke ERES. Phanele e ka tlase ho (B) le phanele ho (C) di bontsha ditshwantsho tse sebeditsweng ho bontsha feela thepa e teng ho ERES (magenta) [Gas1-GFP (e putswa) le Mid2-iRFP (e putswa e bobebe)]. (C) Motsu o bulehileng: ERES e jara karolo e le 'ngoe feela ea thepa (1 ho isa ho 4). Motsu o moputsoa: ERES e na le thepa e arotsoeng (5). Motsu o tiileng o mosoeu: ERES e na le thepa e kopantsoeng. Ka tlase: ERES e le 'ngoe e khethiloeng e na le Gas1-GFP (1) kapa Mid2-iRFP (2) feela. Sekala sa scale, 100 nm. (D) Tekanyo ea photomicrograph e hlalositsoeng ho (C). Peresente e tloaelehileng ea ERES e nang le thepa e le 'ngoe feela (Gas1-GFP kapa Mid2-iRFP), thepa e arotsoeng le thepa e kopaneng. Litekong tse tharo tse ikemetseng, n=432 liseleng tse 54. Sekala sa phoso = SD. Teko ea t e sa kopantsoeng ka mehatla e 'meli. *** P = 0.0002. (E) Setšoantšo sa 3D sa ERES e khethiloeng ea thepa e arotsoeng e tšoailoeng ka (C). Gas1-GFP (e tala) (3) kapa Mid2-iRFP (e putsoa) (4) e kena ERES (magenta) ho tloha lehlakoreng le leng 'me e lekanyelitsoe sebakeng se senyenyane ka har'a ERES. Ka linako tse ling, mefuta ena ka bobeli ea thepa e kena ka har'a ERES (5) e tšoanang ho tloha lehlakoreng le le leng 'me e koaletsoe sebakeng se arohaneng ka har'a ERES. Sekala sa 100 nm.
Ka mor'a moo, re ile ra leka khopolo-taba ea hore ceramide e telele ea acyl chain (C26) e teng ka har'a lera la ER e khanna lihlopha le ho hlopha Gas1 ka ho khetheha ho ERES. Ho fihlela sena, re sebelisitse mofuta oa tomoso o fetotsoeng GhLag1, moo li-synthase tse peli tsa ceramide tsa Lag1 le Lac1 li ileng tsa nkeloa sebaka ke GhLag1 (homolog ea Lag1 ea k'hothone), e leng se ileng sa fella ka mofuta oa tomoso o nang le lera la sele mofuta oa Ceramide o mokhutšoanyane ho feta mofuta oa hlaha (Setšoantšo sa 3A) (28). Tlhahlobo ea Mass spectrometry (MS) e bontšitse hore mefuta ea mofuta oa hlaha, 95% ea ceramide eohle ke ceramide e telele haholo (C26), ha ho GhLag1, 85% ea ceramide e telele haholo (C18 le C16). ), ke 2% feela ea ceramide e telele haholo (C26) chain ceramide. Leha li-ceramide tsa C18 le C16 e le tsona li-ceramide tse ka sehloohong tse fumanoeng lera la GhLag1 ho fihlela joale, tlhahlobo ea MS e boetse e tiisitse hore ankora ea GPI ea Gas1-GFP e hlahisitsoeng mofuteng oa GhLag1 e na le ceramide ea C26, e bapisoang le lipids tsa mofuta oa naha. Boleng boa tšoana (Setšoantšo sa 3A) (26). Ka hona, sena se bolela hore enzyme ea ceramide e nchafatsang Cwh43 e khetha haholo C26 ceramide, joalo ka ha ho bontšitsoe ho Setšoantšo sa 26, e kenyelletsa ankora ea GPI ho tsoa ho C26 ceramide e nyane mofuteng oa GhLag1. S2 (29). Leha ho le joalo, lera la sele la GhLag1 ha e le hantle le na le C18-C16 ceramide feela, ha Gas1-GFP e ntse e na le C26 ceramide. 'Nete ena e etsa hore mofuta ona e be sesebelisoa se loketseng sa ho rarolla bothata ba bolelele ba ketane ea acyl ea membrane ceramide ho ER. Karolo ea boikaketsi ea sehlopha le ho hlopha. Ebe, re qala ka ho ithuta bokgoni ba C26 Gas1-GFP ba ho bokellana ka dihlopha ho GhLag1 ka allele ya mutant e utlwang mocheso ya sec31-1 ka microscopy e tlwaelehileng ya fluorescence, moo ketane e telele feela (C18-C16) e leng teng ka hara lera la ER Ceramide (Setshwantsho sa 3). Re hlokometse hore ka hara sec31-1, boholo ba Gas1-GFP bo ne bo le ka hara dihlopha, ha Gas1-GFP ka hara sec31-1 GhLag1 ka lera le lelelele la ER la ceramide le lelelele (C18-C16) ha bo a ka ba arolwa mme ba ajwa ka hara lera lohle la ER. Ha re nepa hantle, hobane ho bokellana ho thehilweng ho C26 ceramide ho amana haufi le ERES e itseng (Setshwantsho sa 1), re ile ra batlisisa hore na tshebetso ena e ka boela ya kenyelletsa mosebetsi wa mokgwa wa protheine ya kantle ho naha wa ER. GPI-AP e sebedisa sistimi e ikgethang ya COPII bakeng sa kantle ho naha ya ER, e laolwang ka mafolofolo ke ntlafatso ya sebopeho sa Ted1 ya karolo ya glycan ya ankora ya GPI (30, 31). GPI-glycan e kopantsweng hape e lemohuwa ke motsoako wa transmembrane cargo receptor p24, oo ka lehlakoreng le leng o kgethang Lst1, e leng isoform e ikgethang ya subunit e kgolo e tlamang ya COPII cargo Sec24, e leng ho etsa GPI-AP-rich COPII Vesicles di a hlokahala (31-33). Ka hona, re hahile mutant e habeli e kopantseng ho tloswa ha diprotheine tsena tse le nngwe (karolo ya p24 complex Emp24, enzyme e ntjhafatsang GPI-glycan Ted1 le subunit e ikgethang ya COPII Lst1) le mofuta wa sec31-1 mutant, mme ra di ithuta Na ho a kgoneha ho theha Gas1-cluster GFP (Setshwantsho sa 3). Re hlokometse hore ho sec31-1emp24Δ le sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP ha e arolwa mme e ajwa ho pholletsa le lera la ER, jwalo ka ha ho bontshitswe pele ho sec31-1 GhLag1, ha ho sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Jwalo ka sec31-1. Liphetho tsena li bontša hore ntle le boteng ba C26 ceramide ka har'a lera la ER, ho bokellana ha Gas1-GFP le hona ho hloka ho tlamahana le motsoako oa p24, 'me ha ho hloke ho hiroa ho itseng ha Lst1. Eaba, re hlahlobisisa monyetla oa hore bolelele ba ketane ea ceramide ka har'a lera la ER bo ka laola ho tlamahana ha Gas1-GFP ho p24. Leha ho le joalo, re fumane hore boteng ba C18-C16 ceramide ka har'a lera ha bo ame GPI-glycans tse hahiloeng bocha ke motsoako oa p24 (Litšoantšo S3 le S4, A le B) kapa ho tlamahana le bokhoni ba GPI-AP le ho romela kantle ho GPI-AP. Recruit COPII subtype Lst1 (Setšoantšo S4C). Ka hona, ho bokellana ho itšetlehileng ka C26 ceramide ha ho hloke tšebelisano ea protheine le mekhoa e fapaneng ea protheine ea kantle ho ER, empa ho tšehetsa mokhoa o mong oa ho hlophisa o tsamaisoang ke bolelele ba lipid. Eaba, re sekaseka hore na bolelele ba ketane ea ceramide acyl ka har'a lera la ER bo bohlokoa bakeng sa ho arola Gas1-GFP ka katleho e le ERES e khethang. Kaha Gas1 mofuteng wa GhLag1 o nang le ceramide e kgutshwane e tswa ho ER mme e kena ka hara lera la plasma (Setshwantsho sa S5), re dumela hore haeba ho hlopha ho tsamaiswa ke bolelele ba ketane ya ceramide acyl, Gas1 mofuteng wa GhLag1 e ka fetisetswa le ho tshehetswa. Thepa ya ERES e nang le lera le tshwanang.
(A) Lera la sele la GhLag1 haholo-holo le na le li-ceramide tse khutšoane tsa C18-C16, ha ankora ea GPI ea Gas1-GFP e ntse e na le C26 IPC e tšoanang le lisele tsa mofuta oa hlaha. Ka holimo: tlhahlobo ea bolelele ba ketane ea acyl ea ceramide ka har'a lera la sele la mefuta ea hlaha (Wt) le GhLag1p ka mass spectrometry (MS). Lintlha li emela peresente ea kakaretso ea ceramide. Karolelano ea liteko tse tharo tse ikemetseng. Bara ea phoso = SD. Teko ea t e se nang mehatla e 'meli. **** P ＜0.0001. Phanele e ka tlase: Tlhahlobo ea MS ea bolelele ba ketane ea acyl ea IPC e teng ho ankora ea GPI ea Gas1-GFP (GPI-IPC) e hlahisitsoeng mefuteng ea hlaha le ea GhLag1p. Lintlha li emela peresente ea lets'oao lohle la IPC. Karolelano ea liteko tse hlano tse ikemetseng. Bara ea phoso = SD. Teko ea t e se nang mehatla e 'meli. ns, ha ea bohlokoa. P = 0.9134. (B) Di-micrograph tsa Fluorescence tsa sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ le sec31-1lst1Δ tse hlahisang Gas1-GFP e bakwang ke galactose di ile tsa futhumatswa ho 37°C metsotso e 30 mme tsa fetisetswa ho Etsa microscopy ya fluorescence e tlwaelehileng kamora 24°C. Motsu o mosweu: Sehlopha sa ER Gas1-GFP. Motsu o bulehileng: Gas1-GFP e sa kopanngwang e ajwa hodima lera lohle la ER, e bontshang ho daya ha lesale la nuclear la ER. Sekala sa scale, 5μm. (C) Tekanyo ya photomicrograph e hlalositsweng ho (B). Peresente e tloaelehileng ya disele tse nang le sebopeho sa Gas1-GFP se phunyeletsang. Ditekong tse tharo tse ikemetseng, disele tse n≥300. Sekala sa diphoso = SD. Teko ya t e sa kopanngwang ka mehatla e mmedi. **** P ＜0.0001.
Ho rarolla bothata bona ka kotloloho, re entse ponelopele ea SCLIM ea Gas1-GFP le Mid2-iRFP ho GhLag1 ka allele ea mutant e utloang mocheso ea sec31-1 (Setšoantšo sa 4 le Movie S4). Kamora hore ER e bolokoe ho 37°C 'me hamorao e lokolloe ho 24°C, boholo ba Gas1-GFP e sa tsoa etsoa ha ea ka ea aroloa le ho ajoa ho pholletsa le lera la ER, joalo ka ha ho bonoe ke li-microscope tse tloaelehileng (Setšoantšo sa 4, A le B). Ho phaella moo, karolo e kholo ea ERES (67%) e kenyelletsa mefuta e 'meli ea thepa e kopantsoeng ho eona (Setšoantšo sa 4D). Liphanele tsa 1 le tsa 2 tsa Setšoantšo sa 4C li bontša mehlala e 'meli e tloaelehileng ea ERES e nang le Gas1-GFP e kopaneng le Mid2-GFP. Ho phaella moo, thepa ka bobeli e ile ea kenngoa ho ERES e tšoanang (Setšoantšo sa 4E, phanele ea 3 le filimi ea S4). Ka hona, liphetho tsa rona li bontša hore bolelele ba ketane ea ceramide acyl lera la ER ke khetho ea bohlokoa ea ho bokellana le ho arola protheine ea ER.
Lisele tsa Sec31-1 GhLag1 tse hlahisang di-secretion tse bakwang ke galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, e tala) le Mid2-iRFP (TMP, e putsoa) le tse nang le lebitso la ERES tse nang le Sec13-mCherry (ERES, magenta) tse nang le ERES li futhumala mochesong oa 37°C. Tsoela pele metsotso e 30, theohela ho 24°C ho lokolla di-secretion, le setshwantsho ka SCLIM kamora metsotso e 20. (A ho isa ho C) Litšoantšo tse emelang tsa 2D projekto (A; scale bar, 1μm) kapa litšoantšo tsa hemisphere ea sele ea 3D (B le C; scale unit, 0.45μm) tsa likarolo tse 10 tsa z tse tšoailoeng ke cargo le ERES. Phanele e ka tlase ho (B) le phanele ho (C) li bonts'a litšoantšo tse sebetsitsoeng ho bonts'a feela thepa e teng ho ERES (magenta) [Gas1-GFP (e putsoa) le Mid2-iRFP (e putsoa e bobebe)]. (C) Motsu o tletseng o mosweu: ERES, thepa e kopana. Motsu o bulehileng: ERES e na le ntho e le 'ngoe feela. Phanele e ka tlase: ERES e khethiloeng e na le thepa e kopaneng (1 le 2) e tšoailoeng ka (C). Bara ea sekala, 100 nm. (D) Tekanyo ea fotomicrograph e hlalositsoeng ho (C). Liyuniti tsa GhLag1 tsa sec31-1 le sec31-1, ho kenyelelitsoe thepa e le 'ngoe feela (Gas1-GFP kapa Mid2-iRFP), le peresente e tloaelehileng ea ERES bakeng sa thepa e arohaneng le thepa e kopaneng. Litekong tse tharo tse ikemetseng, n = 432 liseleng tse 54 (sec31-1) le n = 430 liseleng tse 47 (sec31-1 GhLag1). Bara ea phoso = SD. Teko ea t e sa kopantsoeng ka mehatla e 'meli. *** P = 0.0002 (sec31-1) le ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Setšoantšo sa 3D sa ERES e khethiloeng e nang le thepa e kopaneng (3) e tšoailoeng ka (C). Gas1-GFP (e tala) le Mid2-iRFP (e putsoa) li atamela ERES (magenta) ho tloha lehlakoreng le le leng 'me li lula sebakeng se le seng se thibetsoeng sa ERES. Sekala sa tekanyo, 100 nm.
Phuputso ena e fana ka bopaki bo tobileng ba hore thepa ea protheine e thehiloeng ho lipid e arotsoe libakeng tse khethiloeng tsa ho romela kantle ho naha tseleng ea secretory, 'me e senola bohlokoa ba bolelele ba ketane ea acyl bakeng sa khetho ea lihlopha. Re sebelisa mokhoa o matla le oa morao-rao oa microscopy o bitsoang SCLIM, re bontšitse Gas1-GFP e sa tsoa etsoa (lera le leholo la plasma GPI-AP le nang le karolo e telele haholo ea acyl ketane (C26) ceramide lipid) ka har'a tomoso) Libaka tse kopantsoeng ka li-ER tse arohaneng li amahanngoa le ERES e itseng, ha liprotheine tse nkiloeng ka transmembrane li ajoa ho pholletsa le lera la ER (Setšoantšo sa 1). Ho phaella moo, mefuta ena e 'meli ea thepa e kena ka ERES e fapaneng ka khetho (Setšoantšo sa 2). Bolelele ba ketane ea acyl ea ceramide ea sele ka har'a lera bo fokotsehile ho tloha ho C26 ho ea ho C18-C16, sehlopha sa Gas1-GFP se sitisoa sebakeng sa ER se arohaneng, 'me Gas1-GFP e fetisetsoa sebakeng se seng ho tloha ER le protheine ea transmembrane ka ERES e tšoanang (Setšoantšo sa 3 le Setšoantšo sa 3). 4).
Leha GPI-AP e sebedisa mokgwa o ikgethang wa protheine ho tswa ho ER, re fumane hore karohano e itshetlehileng ka C26 ceramide ha e itshetlehe ka dikamano tse fapaneng tsa protheine tse ka lebisang ho kgethollo ya ERES (Ditshwantsho S4 le S5). Ho ena le hoo, diphuputso tsa rona di tshehetsa mokgwa o mong wa ho arola o kgannwang ke ho bokellana ha protheine e thehilweng hodima lipid le ho qhelelwa ka thoko ha thepa e meng ka mora moo. Diphuputso tsa rona di bontsha hore sebaka kapa sehlopha sa Gas1-GFP se amanang le ERES e itseng ha se na protheine e ntshitsweng ka transmembrane Mid2-iRFP, e leng se bontshang hore sehlopha sa GPI-AP se itshetlehileng ka C26 ceramide se tla nolofatsa ho kena ha tsona ho ERES e amehang, mme ka nako e ts'oanang, se qhelele ka thoko transmembrane Dintho tse ntshitsweng di kena ho ERES ena e ikgethang (Ditshwantsho 1 le 2). Ka lehlakoreng le leng, boteng ba di-ceramide tsa C18-C16 ka hara lera la ER ha bo bake hore GPI-AP e thehe dibaka kapa dihlopha, kahoo ha di qhelele ka thoko kapa di nke sebaka sa diprotheine tse ntshitsweng ka transmembrane ho ERES e tshwanang (Ditshwantsho 3 le 4). Ka hona, re sisinya hore C26 ceramide e tsamaise karohano le ho hlopha ka ho nolofatsa ho bokellana ha liprotheine tse hokahaneng le ERES e itseng.
Mokhoa oa ho finyella sehlopha sena se itšetlehileng ka C26 ceramide sebakeng se itseng sa ER? Tšekamelo ea membrane ceramide ho arohana ka mahlakoreng e ka etsa hore GPI-AP le C26 ceramide li thehe lipids tse nyane le tse laetsoeng hang-hang tikolohong e sa tloaelehang ea lipids ea membrane ea ER e nang le glycerolipids e khutšoane le e sa tlalang. Lihlopha tsa boleng (17, 18). Lihlopha tsena tse nyane tsa nakoana li ka kopanngoa le lihlopha tse kholoanyane, tse tsitsitseng haholoanyane ka mor'a ho tlamahana le p24 complex (34). Tumellanong le sena, re bontšitse hore C26 Gas1-GFP e hloka ho sebelisana le p24 complex ho theha lihlopha tse kholoanyane tse bonahalang (Setšoantšo sa 3). P24 complex ke heterozygous oligomer e entsoeng ka liprotheine tse 'ne tse fapaneng tsa p24 transmembrane ka har'a tomoso (35), e fanang ka ho tlamahana ka bongata, e ka lebisang ho hokahaneng ha lihlopha tse nyane tsa GPI-AP, ka hona e hlahisa sehlopha se seholo sa Stable (34). Tšebelisano pakeng tsa li-ectodomain tsa protheine tsa GPI-APs le tsona li ka kenya letsoho ho kopaneng ha tsona, joalo ka ha ho bontšitsoe nakong ea ho tsamaisoa ha tsona ke Golgi liseleng tsa epithelial tse nang le polarized tse tsoang ho mammalian (36). Leha ho le joalo, ha ceramide ea C18-C16 e le teng ka har'a lera la ER, ha motsoako oa p24 o tlama ho Gas1-GFP, lihlopha tse kholo tse arohaneng li ke ke tsa thehoa. Mokhoa o ka tlase o ka itšetleha ka thepa e itseng ea 'mele le ea lik'hemik'hale ea ceramide e telele ea acyl. Lithuto tsa biophysical tsa lera la maiketsetso li bontša hore leha li-ceramide tse telele (C24) le tse khutšoane (C18-C16) tsa acyl li ka baka karohano ea mekhahlelo, ke li-ceramide tse telele tsa acyl (C24) feela tse ka khothalletsang ho kobeha ho hoholo le ho kobeha ha filimi ho bopa filimi bocha. Ka ho referensea hammoho (17, 37, 38). Ho bontšitsoe hore helix ea transmembrane ea TMED2, e leng homologue ea motho ea Emp24, e sebelisana ka mokhoa o ikhethileng le sphingomyelin e thehiloeng ho C18 ceramide ka har'a li-lobule tsa cytoplasmic (39). Ha re sebelisa li-simulation tsa limolek'hule (MD), re fumane hore li-ceramide tsa C18 le C26 ka bobeli li bokellana ho potoloha li-lobule tsa cytoplasmic tsa helix ea transmembrane ea Emp24, 'me li na le likhetho tse tšoanang (Setšoantšo sa S6). Hoa bohlokoa ho hlokomela hore sena se bontša hore helix ea transmembrane ea Emp24 e ka lebisa kabong e sa lekanang ea lipid ka har'a lera. Ena ke sephetho sa morao tjena se thehiloeng liseleng tsa mammalian. Li-simulation tse tšoanang tsa MD li boetse li bontša boteng ba li-lipid tsa ether (40). Ka hona, re nahana hore ceramide ea C26 ka har'a li-lobule tse peli tsa ER26 e ruisitsoe sebakeng seo. Ha GPI-AP ka har'a li-lobule tsa luminal e tlama ka ho toba ho p24 e nang le li-valent tse ngata 'me ho bokellana ha C26 ceramide ho potoloha p24 ka har'a li-lobule tsa cytoplasmic, e ka khothalletsa ho bokellana ha protheine le ho kobeha ha lera ho hlahisoa ka menoana (41), e leng se etsang hore GPI-AP e arohane ka libaka tse arohaneng tse haufi le ERES, e leng se boetse se ratang libaka tse kobehileng haholo tsa lera la ER (42). Litlaleho tse fetileng li tšehelitse mokhoa o reriloeng (43, 44). Ho tlama ha li-oligolectins ka li-valent tse ngata, likokoana-hloko kapa li-antibodies ho li-glycosphingolipids tse thehiloeng ho ceramide (GSL) holim'a lera la plasma ho baka ho kopana ho hoholo ha GSL, ho ntlafatsa karohano ea mekhahlelo le ho baka ho fetoha ha lera le ho kenella kahare (44). Iwabuchi jj. (43) Ho fumanoe hore boteng ba liketane tse telele tsa acyl (C24) empa e seng tse kgutshwane (C16), ligand e nang le di-multivalent e tlamilweng ho GSL lactosylceramide e bakile ho thehwa ha dihlopha tse kgolo le ho kenngwa ha lera, mme phetisetso ya letshwao e tsamaiswang ke cytoplasm Lyn dipampitshaneng e kopantswe ke diketane tsa acyl ka di-neutrophil tse kopaneng.
Liseleng tsa epithelial tse nang le polarized tse tsoang ho mammalian, mahloriso a marang-rang a anti-Golgi (TGN) ho ea boemong ba lera la plasma la apical a laola karohano le ho hlophisoa ha GPI-AP (10, 45). Ho bokellana hona ho tsamaisoa ke GPI-AP oligomerization (36), empa ho ka boela ha itšetleha ka bolelele ba ketane ea ceramide boo re bo fumanang ho tomoso. Le hoja GPI-AP ea mammalian e na le ankora e thehiloeng ho ether lipid, 'me sebopeho sa eona sa lik'hemik'hale se fapane haholo le ceramide e telele haholo ea acyl, phuputso ea morao tjena e fumane hore lipids ka bobeli li na le thepa ea 'mele le ea lik'hemik'hale e tšoanang ka ho iphetola ha lintho (40). Ka hona, karolo ea lipid ea ether liseleng tsa mammalian e ka tšoana le ceramide ea C26 ho tomoso, 'me karolo ea eona ke ho amahanngoa le ceramide e telele ka har'a lera ho khothaletsa ho bokella le ho hlopha GPI-AP. Leha monyetla ona o ntse o hloka ho lekoa ka kotloloho, diphuputso tse fetileng di tshehetsa hore ho tsamaiswa ha ceramide e telele ya acyl chain ho ya mmeleng wa Golgi ha ho etswe ke diprotheine tsa phetisetso ya cytoplasmic, empa ho itshetlehile ka ho kopanngwa ha diankora tsa GPI jwalo ka tomoso. Ka hona, mokgwa wa ho iphetola ha dintho o bonahala o kgona ho tsamaisa ceramide e telele haholo ya acyl chain le GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ka vesicle e tshwanang ya phetisetso.
Litsamaisong tsa lisele tsa epithelial tse nang le polarized tomoso le tse anyesang, ho bokellana ha GPI-AP le karohano ho tsoa liprotheineng tse ling tsa plasma membrane kaofela li etsahala pele li fihla holim'a sele. Paladino le ba bang (48) ba fumane hore ho TGN ea lisele tsa epithelial tse nang le polarized tsa mammalian, ho bokellana ha GPI-AP ha ho hlokahale feela bakeng sa ho arola GPI-APs ka khetho ho lera la plasma la apical, empa hape ho laola mokhatlo oa lihlopha tsa GPI-APs le ts'ebetso ea eona ea baeloji. Bokaholimo ba sele. Ho lera la tomoso, thuto ena e bontšitse hore sehlopha sa GPI-AP se itšetlehileng ka C26 ceramide ho ER se ka laola mokhatlo oa lihlopha le ts'ebetso ea GPI-AP lera la plasma (24, 49). Ho latela mohlala ona, lisele tsa GhLag1 li na le allergy ho li-inhibitor tsa GPI kapa lithethefatsi tse amang botšepehi ba lerako la sele (28), 'me tlhoko ea lihlopha tsa Gas1-GFP tse sebetsang (49) tsa ntlha ea ceramide e boletsoeng ho ho kopana ha lisele tsa tomoso e bontša G​​ Litlamorao tse ka bang teng tsa 'mele tsa lisele tsa hLag1. Phoso ea GPI-AP. Leha ho le jwalo, ho hlahloba ho eketsehileng hore na tlhophiso e sebetsang ya bokaholimo ba sele e hlophisitswe ho tloha ho ER ka mokgwa wa ho hlopha ho latela bolelele ba lipide e tla ba taba ya dipatlisiso tsa rona tsa nakong e tlang.
Mefuta ea Saccharomyces cerevisiae e sebelisitsoeng mosebetsing ona e thathamisitsoe ho Tafole S1. Mefuta ea MMY1583 le MMY1635 ea SCLIM bakeng sa ho nka litšoantšo tsa lisele tse phelang e hahiloe ka morao ho W303. Mefuta ena e hlahisang Sec13-mCherry ka tag ea protheine e khanyang e hahiloe ho sebelisoa mokhoa o thehiloeng ho polymerase chain reaction (PCR) ka pFA6a plasmid e le template (23). Mofuta o hlahisang Mid2-iRFP o ngotsoeng ka protheine e khanyang tlas'a taolo ea promoter ea GAL1 o hahiloe ka tsela e latelang. Ho atolosoa ha PCR ha tatellano ea iRFP-KanMx ho tsoa ho vector ea pKTiRFP-KAN (mpho ea E. O'Shea, nomoro ea plasmid ea Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifier ea mohloli oa lipatlisiso (RRID): Addgene_64687) 'Me e kentsoe ho C-terminus ea Mid2 ea tlhaho. Kamora hore tatellano ea liphatsa tsa lefutso tsa Mid2-iRFP e atolosoe le ho kopanngoa ho promoter ea GAL1, e ile ea kopanngoa sebakeng sa Not I-Sac I sa plasmid pRS306 ea integration. Plasmid pRGS7 e hlahisitsoeng e ile ea kopanngoa ka mola o otlolohileng le Pst I ho kopanngoa le sebaka sa URA3.
Jini ya fusion ya Gas1-GFP e hlahiswa tlasa taolo ya promoter ya GAL1 ka hara plasmid ya centromere (CEN), e hahilweng ka tsela e latelang. Tatellano ya Gas1-GFP e ile ya eketswa ke PCR ho tswa ho pRS416-GAS1-GFP plasmid (24) (mpho ya L. Popolo) mme ya kopanngwa sebakeng sa Xma I–Xho I sa CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (mpho ya C). Miller; nomoro ya plasmid ya Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid e hlahisitsweng e ile ya rewa pRGS6. Jini ya fusion ya Axl2-GFP le yona e hlahiswa tlasa taolo ya promoter ya GAL1 ya vector ya pBEVY-GL LEU2, mme kaho ya yona e tjena. Tatellano ea Axl2-GFP e ntlafalitsoe ho tsoa ho pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) ka PCR, 'me ea kopanngoa sebakeng sa Bam HI-Pst I sa vector ea pBEVY-GL LEU2. Plasmid e hlahisitsoeng e ile ea rehoa pRGS12. Tatellano ea li-oligonucleotide tse sebelisitsoeng thutong ena e thathamisitsoe ho Tafole ea S2.
Mofuta ona o ile oa tlatsetsoa ka 0.2% adenine le 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] protheine e ngata ea tomoso e ntšang p (YP) medium (1% tomoso e ntšang le 2% protein ept). (YPR)] kapa 2% galactose [YP-galactose (YPG)] e le mohloli oa khabone, kapa ka har'a medium e nyenyane ea maiketsetso (0.15% tomoso ea naetrojene motheo le 0.5% ammonium sulfate) ho tlatsa li-amino acid le metheo e hlokahalang bakeng sa phepo e nepahetseng, 'me e na le 2% glucose (medium e nyenyane ea glucose e entsoeng ka maiketsetso) kapa 2% galactose (medium e nyenyane ea galactose e entsoeng ka maiketsetso) e le mohloli oa khabone.
Bakeng sa ho nka ditshwantsho tsa nako ya sebele, disele tse fetotsweng tse utlwang mocheso tsa sec31-1 tse hlahisang sebopeho tlasa promoter ya GAL1 di hodisitswe sebakeng se mahareng sa YPR ka 24°C bosiu bohle ho isa karolong ya bohareng ba log. Kamora ho kenya YPG ka 24°C ka hora e le nngwe, disele di ile tsa futhumatswa ka SG ka 37°C ka metsotso e 30, mme tsa fetisetswa ho 24°C ho lokolla ho tloha ho secretion block. Concanavalin A e sebediseditswe ho lokisa disele hodima slide ya khalase mme ya nkuwa setshwantsho ke SCLIM. SCLIM ke motsoako oa microscope ea Olympus IX-71 e fetotsoeng ke fluorescence le lense ea oli ea aperture ea UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), sekenara sa confocal sa disc se potolohang ka lebelo le phahameng (Yokogawa Electric), spectrometer e ikhethileng, le pholiso e ikhethileng. Sesebelisoa sa ho eketsa setšoantšo sa sistimi (Hamamatsu Photonics) se ka fana ka sistimi ea lense e holisang ka keketseho ea ho qetela ea ×266.7 le khamera ea sesebelisoa se kopantsoeng ka tjhaja e atisang lielektrone (Hamamatsu Photonics) (21). Ho fumana setšoantšo ho etsoa ke software e ikhethileng (Yokogawa Electric). Bakeng sa litšoantšo tsa 3D, re sebelisitse actuator ea piezoelectric e entsoeng ka mokhoa o ikhethileng ho thothometsa lense ea sepheo ka ho otloloha, 'me ra bokella likarolo tsa optical tse arohaneng ka 100 nm ka har'a stack. Setšoantšo sa Z-stack se fetoloa data ea voxel ea 3D, 'me mosebetsi oa ho hasanya lintlha tsa theory o sebelisoang bakeng sa microscope ea confocal ea disc e potolohang o sebelisoa bakeng sa ts'ebetso ea deconvolution ke software ea Volocity (PerkinElmer). Ka ho sebedisa software ya Volocity ho lekanya ka boiketsetso bakeng sa tlhahlobo ya sebaka se le seng, ERES ho kenyeletswa le thepa e ne e lekanngwa. Tlhahlobo ya ho skena mela e entswe ka ho sebedisa software ya MetaMorph (Disebediswa tsa Molecular).
Sebelisa software ea GraphPad Prism ho fumana bohlokoa ba lipalo-palo. Bakeng sa teko ea t ea Seithuti sa mehatla e 'meli le tlhahlobo e tloaelehileng ea tsela e le 'ngoe ea variance (ANOVA), liphapang lipakeng tsa lihlopha li nkoa li na le tšusumetso e kholo ho P <0.05 (*).
Bakeng sa microscopy ea fluorescence ea Gas1-GFP, lisele tsa phase ea log li ile tsa holisoa bosiu bohle ho YPD 'me tsa bokelloa ka centrifugation, tsa hlatsuoa habeli ka saline e nang le phosphate buffered, 'me tsa beoa leqhoeng bonyane metsotso e 15, ebe li tsoela pele tlas'a microscope joalo ka ha ho hlalositsoe pele. Check (24). Microscope ea Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) e nang le lense ea sepheo, sefe ea L5 (GFP), khamera ea Hamamatsu le software ea Application Suite X (LAS X) li ile tsa sebelisoa bakeng sa ho fumana.
Disampole di ile tsa tloswa ka SDS sample buffer ho 65°C metsotso e 10, mme tsa arolwa ka SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Bakeng sa tlhahlobo ya immunoblotting, 10 μl ya sampole e ile ya kenngwa ka mola o le mong. Antibody ya mantlha: Sebedisa anti-Gas1 ya mmutla ya polyclonal ka ho hlapollwa ha 1:3000, anti-Emp24 ya mmutla ya polyclonal ka ho hlapollwa ha 1:500, le anti-GFP ya mmutla ya polyclonal (mpho e tswang ho H. Riezman) ka ho hlapollwa ha 1:3000. Antibody ya mouse monoclonal anti-Pgk1 e sebedisitsweng ka ho hlapollwa ha 1:5000 (mpho e tswang ho J. de la Cruz). Antibody ya bobedi: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) e sebedisitsweng ka ho hlapollwa ha 1:3000 (Pierce). IgG ea podi e kopantsoeng le HRP e sebelisitsoe ka ho hlapolloa ha 1:3000 (Pierce). Sebaka sa karabelo ea 'mele ea ho itšireletsa mafung se ile sa bonoa ka mokhoa oa chemiluminescence oa SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Jwalo ka ha ho hlalositswe ho (31), teko ya tlhaho ya immunoprecipitation e entswe hodima karolo e nonneng ya ER. Ka bokhutshwane, hlatswa disele tsa tomoso ka TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride le motsoako wa protease inhibitor) ho 600 nm (OD600) ho 100 optical density habeli. E ile ya robeha ka difaha tsa khalase, mme ditshila tsa sele le difaha tsa khalase tsa tloswa ka centrifugation. Supernatant e ile ya centrifugation ho 17,000 g metsotso e 15 ho 4°C. Pellet e ile ya tshwarwa hape ho TNE mme digitalis saponin ya eketswa ho ya hodimo ya 1%. Ho emisoa ho ile ha kenngwa ka hora e le nngwe ka ho potoloha ho 4°C, mme dikarolo tse sa qhibiliheng di ile tsa tloswa ka centrifugation ho 13,000 g ho 4°C metsotso e 60. Bakeng sa Gas1-GFP immunoprecipitation, qala ka ho kenya sampole pele ka li-agarose beads tse se nang letho (ChromoTek) ho 4°C ka hora e le 'ngoe, ebe u e kenya ka GFP-Trap_A (ChromoTek) ho 4°C ka lihora tse 3. Li-beads tse nang le immunoprecipitation li hlatsoitsoe ka makhetlo a mahlano ka TNE e nang le 0.2% digoxigenin, tsa tlosoa ka SDS sample buffer, tsa aroloa ho SDS-PAGE, 'me tsa hlahlojoa ka immunoblotting.
Jwalo ka ha ho hlalositswe ho (31), ho etswa qeto ya ho hokahanya karolo e matlafaditsweng ya ER. Ka bokgutshwanyane, karolo e matlafaditsweng ya ER e ile ya kenngwa ka dithiobis tsa 0.5 mM (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, metsotso e 20). Karabelo ya ho hokahanya e ile ya tingwa ka ho eketsa glycine (maikutlo a ho qetela a 50 mM, metsotso e 5, 20°C).
Jwalo ka ha ho hlalositswe pele (50), tlhahlobo ya MS ya ceramide mefuteng ya tlhaho le ya GhLag1 e entswe. Ka bokhutshwane, disele di hodisitswe ho ya ho karolo ya exponential (3 ho isa ho 4 OD600 units/ml) ho YPD ka 30°C, mme disele tse 25×107 di ile tsa kotulwa. Metabolism ya tsona e tingwa ka trichloroacetic acid. Sebedisa solvent ya ho ntsha [ethanol, metsi, ether, pyridine le 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] le 1.2 nmol ya boleng ba ka hare ba C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid)). Sebedisa monomethylamine reagent [methanol, metsi, n-butanol le methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] ho etsa alkaline hydrolysis e bobebe ya extract, ebe o sebedisa n-butanol e tletseng metsi ho tlosa letswai. Qetellong, setlolo se ile sa tshwaetswa hape ka solvent ya mokgwa o motle [chloroform/methanol/water (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] mme sa kenngwa ka hara spectrometer ya bongata. Ho entswe tlhokomelo ya dikarabelo tse ngata (MRM) bakeng sa ho hlwaya le ho lekanya dimolek'hule tsa sphingolipid. TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) e na le mohlodi wa ion wa robotic nanoflow Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) bakeng sa tlhahlobo ya lipid. Matla a ho thulana a ntlafaditswe bakeng sa sehlopha se seng le se seng sa ceramide. Lintlha tsa MS di fumanwe ka mokgwa o motle. Bakeng sa kopi e nngwe le e nngwe ya baeloji, letshwao la lipid ke bohareng ba ditekanyo tse tharo tse ikemetseng.
Jwalo ka ha ho hlalositswe ho (31), disele (800×107) tse hlahisang Gas1-GFP di ile tsa kenngwa tshebetsong ya tlhaho ya ho itshireletsa mafung. Gas1-GFP e hlwekisitsweng e ile ya arolwa ke SDS-PAGE mme ya fetisetswa lera la polyvinylidene fluoride (PVDF). Protheine e ile ya bontshwa ka ho daya PVDF ka amide black. Lebanta la Gas1-GFP le ile la kgaolwa ho tloha ho PVDF mme la hlatsuwa ka makgetlo a 5 ka methanol mme hang ka metsi a sehlopha sa di-chromatography-MS (LC-MS). Ka ho kenya lera la lera ka motswako wa 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer le 500μl o sa tswa qhibilihiswa wa 1 M sodium nitrite ka 37°C ka dihora tse 3, karolo ya lipid e lokollwa ho Gas1-GFP mme ya laetswa. Ho lokollwa ha inosine phosphate ceramide pakeng tsa glucosamine le inositol (51). Kamora moo, lera la lera le ile la hlatsuoa ka makhetlo a mane ka metsi a sehlopha sa LC-MS, la omisoa mochesong oa kamore, 'me la bolokoa moeeng oa naetrojene ho -80°C ho fihlela tlhahlobo. E le taolo, sampole e se nang letho ea lera la PVDF e ile ea sebelisoa bakeng sa teko ka 'ngoe. Lipid e ntšitsoeng ho Gas1-GFP e ile ea hlahlojoa ke MS joalo ka ha ho hlalositsoe (50). Ka bokhutšoanyane, li-strips tsa PVDF tse nang le GPI-lipid li ile tsa emisoa hape ka har'a solvent ea hlobo e mpe ea 75μl [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] 'me tsa fetisoa ka electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis ea mefuta ea sphingolipid (TSQ Vantage). Tabeng ena, data ea MS e fumanoe ka mokhoa oa ion e mpe.
Jwalo ka ha ho boletswe pejana, karolo ya lipid ya ankora ya GPI e ile ya arolwa ho [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). Dilipid di ile tsa arolwa ka chromatography e nang le lera le lesesane ho sebediswa sistimi ya solvent (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) mme tsa bontshwa ka setshwantsho ho sebediswa FLA-7000 (Fujifilm).
Lisele tse hlahisang Gas1-GFP (600×107) li hlatsuoe habeli ka buffer ea TNE e nang le buffer ea TNE, 'me tsa rojoa ka lifaha tsa khalase, eaba li kenngoa ka seterifung ho tlosa lithōle tsa sele le lifaha tsa khalase. Supernatant e ile ea kenngoa ka seterifung ho 17,000 g ka hora e le 'ngoe mochesong oa 4°C. Pellet e ile ea hlatsuoa ka TNE 'me ea kenngoa ka seterifung ka 1 U PI-PLC (Invitrogen) ho TNE e nang le 0.2% digitalis saponin ka hora e le 'ngoe mochesong oa 37°C. Kamora kalafo ea enzyme, lera le ile la tlosoa ka seterifung ho 17,000 g ho 4°C ka hora e le 'ngoe. Ho thibela immunoprecipitate Gas1-GFP, supernatant e ile ea kenngoa ka seterifung ka GFP-Trap_A (ChromoTek) ho 4°C bosiu bohle. Gas1-GFP e hloekisitsoeng e arotsoeng ke SDS-PAGE e ile ea daea ka Coomassie brilliant blue. Sehlopha sa ho taka sa Gas1-GFP se ile sa khaoloa ho tloha bohlooho bo potileng mokero oa metsi, 'me ka mor'a ho kopanya le iodoacetamide le ho fokotsa ka dithiothreitol, ho ile ha etsoa tšilo ea lijo ka gel ka trypsin. Ho ntšoa le ho omisa li-peptide tsa tryptic le li-peptide ka GPI-glycans. Peptide e omisitsoeng e ile ea qhibilihisoa ka har'a 20 μl ea metsi. Kenya karolo (8μl) ka har'a LC. Kholomo ea octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; bophara ba ka hare ba 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japane) e ile ea sebelisoa ho arola li-peptide tlas'a maemo a itseng a gradient. Mokhahlelo o tsamaeang ke solvent A (0.08% formic acid) le solvent B (0.15% formic acid ka 80% acetonitrile). Sistimi ea Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) e sebelisitsoe ho tlosa kholomo ka solvent A ka hare ho metsotso e 55 ka sekhahla sa phallo ea 50 μl min-1 metsotso e 5, ebe khatello ea solvent B e ekelitsoe ho 40%., United States). Eluate e ile ea kenngoa ka mokhoa o tsoelang pele mohloling oa ion oa ESI, 'me li-peptide tsa tryptic le li-peptide tse nang le GPI-glycans li ile tsa hlahlojoa ke LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Sethaleng sa MS, motlakase oa mohloli oa capillary o ile oa beoa ho 4.5 kV, 'me mocheso oa capillary ea phetisetso o ile oa bolokoa ho 300°C. Voltage ea capillary le voltage ea lense ea tube li ile tsa beoa ho 15 V le 50 V, ka ho latellana. Lintlha tsa MS li fumanoe ka mokhoa oa positive ion (qeto ea 60,000; ho nepahala ha boima ba likarolo tse 10 ka milione) ka tekanyo ea boima ba 300/m/z boima/tjhaja (m/z) 3000. Lintlha tsa MS/MS li fumanoa ka leraba la ion ho LTQ Orbitrap XL [linomoro tse 3 tsa pele tseo data e itšetlehileng ka tsona, karohano e bakoang ke khohlano (CID)].
Diketsiso tsa MD di entswe ho sebediswa software ya GROMACS (52) le MARTINI 2 force field (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) e ile ya sebediswa ho aha bilayer e nang le dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) le Cer C18 kapa DOPC le Cer C26. Topology le dikhokahano tsa Cer C26 di nkwa ho DXCE ka ho tlosa dibead tse eketsehileng mohatleng wa sphingosine. Sebedisa tshebetso e hlalositsweng ka tlase ho leka-lekanya lera le habeli mme o le tsamaise, ebe o sebedisa dikhokahano tsa ho qetela tsa sistimi ho aha sistimi e nang le Emp24. Sebaka sa transmembrane sa tomoso Emp24 (masalla a 173 ho isa ho 193) se hahilwe e le α-helix ho sebediswa sebopeho sa dimolek'hule sa sesebediswa sa visual MD (VMD) (58). Yaba, kamora ho tlosa di-lipid tse kopaneng, protheine e ile ya granulated ka mahoashe mme ya kenngwa ka bilayer ho sebediswa CHARMM GUI. Sistimi ea ho qetela e na le 1202 DOPC le 302 Cer C26 kapa 1197 DOPC le 295 Cer C18 le Emp24. Ionise sistimi ho fihlela e le mahloriso a 0.150M. Ho entsoe likopi tse 'ne tse ikemetseng bakeng sa metsoako e 'meli ea likarolo tse peli.
Mokhahlelo wa lipidi o leka-lekana ho sebediswa tshebetso ya CHARMM GUI, e kenyeletsang ho fokotsa le ho leka-lekanya mehato e 405,000, moo dithibelo tsa boemo di fokotswang le ho fediswa butle-butle, mme mohato wa nako o eketswa ho tloha ho 0.005 ps ho isa ho 0.02 ps. Kamora ho leka-lekana, e hlahisa 6 µs ka mohato wa nako wa 0.02 ps. Kamora ho kenya Emp24, sebedisa mokgwa o tshwanang wa CHARMM GUI ho fokotsa le ho leka-lekanya sistimi, ebe o sebetsa metsotso e 8 tlhahisong.
Bakeng sa litsamaiso tsohle, nakong ea ts'ebetso ea ho leka-lekanya, khatello e laoloa ke barostat ea Berendsen (59), 'me nakong ea ts'ebetso ea tlhahiso, khatello e laoloa ke barostat ea Parrinello-Rahman (60). Maemong 'ohle, khatello e tloaelehileng ke bare e le 1 'me ho sebelisoa morero oa ho kopanya khatello ea semi-isotropic. Ts'ebetsong ea ho leka-lekanya le tlhahiso, thermostat (61) e nang le ho leka-lekanya lebelo e sebelisoa ho kopanya mocheso oa liprotheine, lipid le likaroloana tse qhibilihang ka ho latellana. Nakong ea ts'ebetso eohle, mocheso o reriloeng ke 310K. Tšebelisano e sa amaneng e baloa ka ho hlahisa lethathamo la ho kopanya ho sebelisoa morero oa Verlet ka mamello ea buffer ea 0.005. Lentsoe la Coulomb le baloa ho sebelisoa tšimo ea karabelo le sebaka sa ho khaola sa 1.1 nm. Lentsoe la Vander Waals le sebelisa morero oa ho khaola o nang le sebaka sa ho khaola sa 1.1 nm, 'me morero oa ho khaola oa Verlet o sebelisoa bakeng sa ho kheloha ho ka bang teng (62).
Ho sebelisoa VMD, bolelele ba leqhubu la cutoff pakeng tsa li-bead tsa phosphate tsa DOPC kapa li-bead tsa ceramide AM1 le protheine ke 0.7 nm, 'me palo ea li-lipid tse sebelisanang le protheine ea baloa. Ho ea ka foromo e latelang, bala ntlha ea depletion-enrichment (DE) joalo ka ha ho le ho (63): DE factor = (palo ea li-lipids tsohle protheineng 0.7) protheineng 0.7 (palo ea Cer ho li-lipids tsohle)
Boleng bo tlalehiloeng bo fumanoa e le karolelano, 'me mekoallo ea liphoso ke likopi tse 'ne tse ikemetseng tsa SE. Bohlokoa ba lipalo-palo ba DE factor bo baloa ka teko ea t [(averageDE-factor-1)/SE]. Bala boleng ba P ho tsoa kabong e nang le mohatla o le mong.
Sesebelisoa sa GROMACS se sebelisitsoe ho bala 'mapa oa 2D lateral density oa sistimi e nang le Emp24 ka har'a 250 ns ea ho qetela ea trace. E le ho fumana 'mapa oa ho ruisa/ho fokotsa ceramide, 'mapa oa density oa Cer o arotsoe ka kakaretso ea 'mapa oa Cer le DOPC, ebe o aroloa ka mahloriso a Cer 'meleng. Ho sebelisoa sekala se tšoanang sa 'mapa oa' mala.
Bakeng sa lisebelisoa tse ling bakeng sa sengoloa sena, ka kopo sheba http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ena ke sengoloa se bulehileng se ajoang tlas'a lipehelo tsa Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, e lumellang tšebeliso, kabo le tlhahiso-leseling ka mokhoa ofe kapa ofe, ha feela tšebeliso ea ho qetela e se bakeng sa phaello ea khoebo 'me motheo ke hore mosebetsi oa pele o nepahetse. Referense.
Tlhokomeliso: Re kopa feela hore o fane ka aterese ea hau ea lengolo-tsoibila e le hore motho eo u mo khothaletsang leqepheng a tsebe hore u batla hore a bone lengolo-tsoibila le hore ha se spam. Re ke ke ra hapa liaterese life kapa life tsa lengolo-tsoibila.
Potso ena e sebelisetsoa ho leka hore na u moeti le ho thibela ho romelloa ha spam ka bohona.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perezgier Lopero, Ana Maria Perezgier Lopero Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Setšoantšo sa 3D sa nako ea sebele se nang le qeto e phahameng se senola bohlokoa ba bolelele ba ketane ea ceramide bakeng sa ho hlophisa protheine libakeng tse khethiloeng tsa tlhahiso.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perezgier Lopero, Ana Maria Perezgier Lopero Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Setšoantšo sa 3D sa nako ea sebele se nang le qeto e phahameng se senola bohlokoa ba bolelele ba ketane ea ceramide bakeng sa ho hlophisa protheine libakeng tse khethiloeng tsa tlhahiso.
©2020 Mokhatlo oa Amerika oa Tsoelo-pele ea Saense. litokelo tsohle li sirelelitsoe. AAAS ke molekane oa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.