Kea leboha ha le etetse Nature.com. Mofuta wa sebatli seo o se sebedisang o na le tshehetso e fokolang bakeng sa CSS. Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetisisa, re kgothaletsa hore o sebedise sebatli se ntjhafaditsweng (kapa o tima mokgwa wa ho tsamaisana le Internet Explorer). Ho sa le jwalo, ho netefatsa tshehetso e tswelang pele, re tla bontsha sebaka sena sa marang-rang ntle le mekgwa le JavaScript.
Ho fapana le diphoofolo tse nang le lesapo la mokokotlo, dikokonyana di nahannwa haholo hore ha di na dihormone tsa steroid tsa thobalano tse sekametseng ho banna. Ho Anopheles gambiae, ecdysone steroid 20-hydroxyecdysone (20E) ho bonahala e fetohile ho laola ntshetsopele ya lehe ha e etswa ke tse tshehadi2 le ho baka nako ya ho kopana e sa laoleheng ha e fetisetswa thobalanong ke tse tona3. Kaha ntshetsopele ya lehe le ho kopana ke makgetha a bohlokwa a ho ikatisa, ho utlwisisa kamoo menoang ya Anopheles e tshehadi e kopanyang matshwao ana a dihormone ho ka nolofatsa moralo wa mananeo a matjha a taolo ya malaria. Mona, re senola hore mesebetsi ena ya ho ikatisa e laolwa ke di-steroid tse fapaneng tsa thobalano ka marangrang a rarahaneng a dienzyme tse sebetsang/tse emisang ecdysteroid. Re hlwaile ecdysone e nang le oxidized e ikgethang ho banna, 3-dehydro-20E (3D20E), e sireletsang botswadi ka ho tima kamohelo ya thobalano ya basadi kamora phetiso ya thobalano le ho e kenya tshebetsong ka dephosphorylation. Haholoholo, phetiso ya 3D20E e boetse e bakile tlhahiso ya dijini tsa ho ikatisa tse bolokang ntshetsopele ya lehe nakong ya tshwaetso ya Plasmodium, ho netefatsa bophelo bo botle ba tse tshehadi tse tshwaeditsweng. 20E e tswang ho basadi ha e hlahise karabelo ea thobalano, empa e lumella batho ba nyalanang ho beha mahe ka mor'a hore li-kinase tse thibelang 20E li thibeloe. Ho tsebahatsa hormone ena ea steroid ea likokoanyana e ikhethang ea banna le karolo ea eona ho laoleng kamohelo ea thobalano ea basali, kemolo le tšebelisano-'moho le Plasmodium ho bontša monyetla oa ho fokotsa katleho ea ho ikatisa ea menoang e fetisang malaria.
Maemo a lefu la malaria le a bakoang ke lefu a ntse a eketseha hape4 ka lebaka la ho hanyetsa likokoanyana tse bolaeang likokoanyana ho menoang ea Anopheles, e leng eona feela e bakang likokoana-hloko tsa malaria ho batho. Baeloji ea ho kopana ha menoang ena ke sepheo se khahlang haholo bakeng sa mekhoa e mecha ea taolo ea malaria hobane tse tšehali li kopana hanngoe feela5; ho etsa hore ketsahalo ena ea ho kopana ha menoang e le 'ngoe e se ke ea bola ho ka ba le monyetla o moholo oa ho fokotsa palo ea menoang tšimong.
Basali ba ba le bothata ba thobalano ka mor'a ho fumana lihormone tsa steroid tse nang le titer e phahameng ho banna. Lithuto li bontšitse hore sesosa sa bothata ba ho kopana hape ke 20-hydroxyecdysone (20E), hormone ea steroid e tsejoang haholo e le molaoli oa potoloho ea ho qhibiliha ha lisele tsa botona le botšehali mohatong oa larval. Bokhoni ba banna ba ho kopanya le ho fetisetsa 20E bo fetohile ka ho khetheha mefuteng ea Anopheles e leng karolo ea mofuta o ka tlase oa Cellia7, o ajoang Afrika 'me o kenyelletsa li-vector tse kotsi ka ho fetisisa tsa malaria, ho kenyeletsoa le Anopheles gambiae. Sena sea hlokomeleha haholo hobane mefuteng ena basali le bona ba hlahisa 20E kamora lijo tse ling le tse ling tsa mali, 'me 20E e khanna potoloho ea oogenesis (sheba ref. 8). Leha ho le joalo, ho tsejoa hanyane ka tsela eo basali ba kopanyang matšoao ho tsoa mehloling e 'meli e fapaneng ea ecdysone (phetisetso ea banna le tlhahiso ea mali) ntle le ho beha bokhoni ba bona ba ho kopana kotsing. Ha e le hantle, haeba 20E e hlahisoang ke basali e baka ho se mamelle thobalano, sena se tla lebisa ho hloka thari ho batho ba anyesang ba sa le moroetsana, e leng boitšoaro bo tloaelehileng haholo ho menoang ena5.
Tlhaloso e ka bang teng ke hore banna ba A. gambiae ba fetisetsa ecdysone e fetotsoeng e ikhethang ho banna, e kenyang tšebetsong phallo ea matšoao tseleng ea ho ikatisa ea basali, e leng se fellang ka ho se tsitse ha ho kopana. Leha ho le joalo, leha liphoofolo tse nang le lesapo la mokokotlo li na le lihormone tse ngata tsa steroid, tse kang estrogen le androgen (tse hlahlobiloeng ho ref. 9), ho ea ka tsebo ea rona, li-steroid tse nang le leeme la androgenic ha li so fumanoe likokoanyana.
Re ikemiseditse ho fumana lenane la dihormone tsa steroid ka hara gland ya accessory ya banna (MAG) ya A. gambiae e hodileng thobalanong ho batla di-steroid tse ka fetolang tse ka bang teng. Re sebedisa chromatography ya metsi e sebetsang hantle e kopantsweng le tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) ho ena le mokgwa o sa totobalang o neng o sebediswe pele, re ile ra fumana ecdysone (E) le 20E ka hara lera lena, ra tiisa sephetho se fetileng. Leha ho le jwalo, sampole e ne e laolwa ke di-steroids tse nang le oxidized phosphorylated, tse tsamaellanang le foromo ya 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Setshwantsho sa 1). Mefuta e meng e kenyelletsa 3-dehydro-20E (3D20E) le 20E-22-phosphate (20E22P). Matla a letshwao la HPLC-MS/MS a 3D20E22P e ne e le ditaelo tse pedi tsa boholo bo hodimo ho feta sebopeho sa yona sa dephosphorylated, 3D20E, le ditaelo tse tharo tsa boholo bo hodimo ho feta tsa E le 20E (Setshwantsho sa 1). Le hoja dikarolong tse ding tsa mmele le tsela e ka tlase ea ho ikatisa (LRT; Setšoantšo sa 1a se Atolositsoeng). Re boetse ra sekaseka li-ecdysteroids ho banna le basali ba sa tsoa koaloa (ba ka tlase ho letsatsi le le leng) 'me ra fumana 3D20E le 3D20E22P feela ho MAG; E, 20E le 20E22P li ne li le teng ho bong ka bobeli (Setšoantšo sa 1b se Atolositsoeng). Lintlha tsena li bontša hore banna ba baholo ba A. gambiae ba hlahisa li-titers tse phahameng tsa lihormone tse fetolang ho MAG ea bona tse sa hlahisoang ke basali.
MAG le LRT e tšehali (ho kenyeletsoa atria, seminal vesicles, le parovarium) li ile tsa aroloa ho banna ba masoha ba matsatsi a 4 (ba lilemo li 4) le basali ba masoha le ba nyetsoeng (0.5, 3, le 12 hpm). Ecdysone liseleng tsena e ile ea hlahlojoa ke HPLC-MS/MS (e tloaelehileng ± sem; tlhahlobo ea t e sa pairwang, e nang le mahlakore a mabeli, sekhahla sa ho sibolloa ha bohata (FDR) se lokisitsoe; NS, ha se bohlokoa; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: Lihora tse 3 khahlanong le lihora tse 0.5, P = 0.035; Lihora tse 12 khahlanong le lihora tse 3, P = 0.0015; Lihora tse 12 khahlanong le lihora tse 0.5, P = 0.030. 3D20E22P: Lihora tse 3 khahlanong le lihora tse 0.5, P = 0.25; Lihora tse 12 khahlanong le lihora tse 3, P = 0.0032; Lihora tse 12 khahlanong le lihora tse 0.5, P = 0.015). Lintlha li tsoa ho likopi tse tharo tsa baeloji. Sebaka se phahameng sa ecdysone ka 'ngoe se khahlisang se baliloe le ho etsoa hore se be se tloaelehileng ka palo ea menoang. Ecdysone e emeloa ke 'mala ka tsela e latelang: E, e tala; 20E, lamunu; 20E22P, e pherese; 3D20E, e putsoa; 3D20E22P, e pinki. Karolo e ka hare e eketsa sekala ho y-axis ho bontša maemo a tlase a ecdysone.
Ho batlisisa hore na 3D20E22P le 3D20E li fetisoa nakong ea ho kopana, re ile ra arola li-LRT tsa basali ka linako tse fapaneng ka mor'a ho kopana. Le hoja ecdysone e sa ka ea fumanoa ho baroetsana, re bone bongata bo boholo ba 3D20E22P ho LRT hang ka mor'a ho kopana (lihora tse 0.5 kamora ho kopana, hpm), bo fokotseha ha nako e ntse e ea, ha maemo a 3D20E a ntse a eketseha haholo (Setšoantšo sa 1). Re sebelisa 3D20E e entsoeng ka lik'hemik'hale e le tekanyetso, re fumane hore maemo a hormone ena ea steroid ho LRTs tsa ho kopana a ne a le bonyane makhetlo a 100 ho feta 20E (Tafole ea Lintlha e Atolositsoeng ea 1). Kahoo, 3D20E22P ke ecdysone e kholo ea banna e fetisetsoang ho LRT ea basali nakong ea ho kopana, 'me sebopeho sa eona se se nang phosphorylated, 3D20E, se ba ngata haholo nakoana ka mor'a ho kopana. Sena se bontša karolo ea bohlokoa bakeng sa ecdysone ea morao ho baeloji ea basali kamora ho kopana.
Kamora ho hlahisa sete e ncha ea data ea tatellano ea RNA (RNA-seq) (Setšoantšo sa 2a), re sebelisa phaephe ea bioinformatics e hahiloeng ka mokhoa o ikhethileng, re batlile ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), le ecdysone e kenyang 20E-modified phosphatase gene.EPP) e hlahisoa liseleng tsa ho ikatisa. Re hlwaile gene e le 'ngoe ea EPP e khethiloeng le liphatsa tse peli tse ka bang teng tsa EcK (EcK1 le EcK2), empa re hlōlehile ho fumana gene e ntle ea EO e khethiloeng. Haholo-holo, liphatsa tsa lefutso tsa EPP ka bomong li hlahisitsoe maemong a holimo (peresente ea 98.9) ho Gambian MAG empa eseng ho li-LRT tsa basali (Setšoantšo sa 2b), ho fapana le litebello tsa rona kaha dephosphorylation ea 3D20E22P e etsahetse liseleng tsena tsa basali. Ka hona, re lumela hore EPP ea banna e ka fetisetsoa nakong ea ho ikatisa. Ka 'nete, re sebelisitse ho ngola isotope e tsitsitseng ea in vivo ho pata protheine ea basali kamora ho ikatisa, enzyme e khethiloeng ke MS ho atrium ea basali (Setšoantšo sa 2c le Tafole e Tlatsetsang 1). Boteng ba EPP ho MAG le LRT e tšehali e kopantsoeng (empa e seng ea moroetsana) le bona bo tiisitsoe ka ho sebelisa li-antibodies tse itseng (Setšoantšo sa 2d).
a, Mokero wa bioinformatics o hahiloeng ka mokhoa o ikgethileng ho batla dinama tsa botona le botšehali tsa bong bo bong bakeng sa dijini tse kenyeletsang di-EcK, di-EO, le di-EPP. Dinomoro tse pela metsu di bontsha palo ya bakgethi ba banna le ba basadi mohatong o mong le o mong.Tlhahlobo ena e hlwaile jini e le nngwe ya EPP (EPP) le jini e le nngwe ya EcK (EcK1) tse hlahiswang ho banna, le jini e le nngwe ya EcK (EcK2) e hlahiswang ho bong ka bobedi empa e sa hlahise jini ya EO e hlahiswang.b, Heatmap e bapisang polelo ya jini ya mokgethi ho virgin (V) le ho nyalana (M) Anopheles gambiae le dinama tsa Anopheles albicans.Spca, manyolo; MAG, di-gland tse thusang ho banna; Likarolo tse ling tsa 'mele, ho kenyeletsoa matsoele, mapheo, maoto, 'mele e mafura, le litho tsa ka hare ho bong ka bobeli, le mae a bomme ho basali. EcK2 e hlahisoa haholo ho MAG le atria ea Gambia, athe EPP e fumanoa feela ho MAG.c, tlhahlobo ea Proteomic ea phetoho ea sehlopha sa ejaculate sa banna ho atria ea basali ka 3, 12 le 24 hpm, e bonts'ang liprotheine tse 67 tse ngata ka ho fetisisa. Basali ba holisitsoe ka lijo tse nang le 15N ho ngola (le ho pata) liprotheine tsohle. Banna ba sa tšoauoang ba ile ba kopanngoa le basali ba nang le li-tag, 'me li-LRT tsa basali li ile tsa aroloa ho 3, 12 le 24 hpm bakeng sa tlhahlobo ea proteomic (sheba Tafole e Tlatsetsang ea 1 bakeng sa lethathamo le felletseng la liprotheine tsa ejaculatory). Karolo e ka hare, EPP, Eck1 le EcK2 li ile tsa fumanoa ho MAG ea banna ba sa tsoaroa ka tlhahlobo ea proteomic ea lisele tsena.d, EPP e ile ea fumanoa ke western blot ho MAG le LRT ea basali ba sa tsoaroa, empa eseng ho basali ba sa tsoaroa kapa banna kapa karolo e setseng ea basali. 'mele. Li-membrane li ile tsa hlahlojoa ka nako e le 'ngoe ka anti-actin (taolo ea ho kenya) le li-antibodies tse khahlanong le EPP. Banna bohle ke baroetsana. Sheba Setšoantšo se Tlatsetsang sa 1 bakeng sa lintlha tsa mohloli oa gel. Li-blots tsa Bophirimela li entsoe habeli ka liphetho tse tšoanang.
Tšebetso ea ecdysteroid phosphophosphatase ea EPP e netefalitsoe ka mor'a ho kenngoa ha HPLC-MS/MS ka 3D20E22P e arotsoeng ho MAG (Extended Data Fig. 2a). Ho feta moo, ha re khutsisa EPP ka RNA-mediated interference (RNAi), re ile ra lemoha phokotso e matla ea ts'ebetso ea phosphatase liseleng tsa ho ikatisa tsa banna bana (Setšoantšo sa 3a), 'me basali ba ileng ba kopana le banna ba khutsisitsoeng ke EPP ba bontšitse bohlokoa Karolo e tlase ea dephosphorylated 3D20E (Setšoantšo sa 3b) ho sa tsotellehe ho khutsisa ha liphatsa tsa lefutso ka karolo (Setšoantšo sa Extended Data Fig. 2b,c). Ka lehlakoreng le leng, ha rea ​​​​ka ra fumana liphetoho tse kholo karolelanong ea 20E22P/20E ho menoang e tšoanang, e leng se ka 'nang sa fana ka maikutlo a hore enzyme e ikhethile bakeng sa 3D20E22P (Setšoantšo sa 3b).
a, Ho fokotseha ha ts'ebetso ea phosphatase ho MAG ho bakoang ke ho khutsisa ha EPP ho sebelisoa li-control tsa EPP RNA (dsEPP) tse nang le marapo a mabeli kapa GFP RNA (dsGFP) tse nang le marapo a mabeli. Ho sebelisitsoe matamo a MAG a mashome a mabeli ho kopi e 'ngoe le e 'ngoe (P = 0.0046, teko ea t e kopantsoeng, e nang le mahlakore a mabeli), e emetsoeng ke matheba a arohaneng.b, Tse tšehali tse kopantsoeng le tse tona tse nang le khutso ea EPP li ne li e-na le karolo e tlase haholo ea 3D20E e sa phosphorylated ho 3 hpm (P = 0.0043, teko ea t e sa kopantsoeng, e nang le mahlakore a mabeli), athe maemo a 20E a ne a sa amehe (P = 0.063, e sa kopantsoeng). teko ea t, e mahlakore a mabeli). Lintlha li hlahisoa e le karolelano ea ± sem ho tsoa matamong a mararo a basali ba 13, 16 le 19 ka 'ngoe. c, Basali ba ileng ba kopana le banna ba khutsisitsoeng ke EPP ba bile le sekhahla se phahameng haholo sa ho kopana hape (P = 0.0002, teko ea Fisher e nepahetseng, e mahlakore a mabeli). Basali ba ile ba qobelloa pele ho kopana ho netefatsa boemo ba bona ba ho kopana; Matsatsi a 2 hamorao, ba ile ba kopana le banna ba bang ba jereng peo ea transgenic ho lekola sekhahla sa ho kopana hape ka ho lemoha ka bongata PCR ea transgene.d, Basali ba fepuoang mali ba ileng ba kopana le banna ba khutsisitsoeng ke EPP ba ne ba fokotsehile haholo ke ho nona (P < 0.0001; teko ea Mann-Whitney, mahlakore a mabeli) le palo ea mahe e fokotsehileng hanyane (P = 0.088, teko ea Mann-Whitney, mahlakore a mabeli), ha sekhahla sa ho tsoala se sa angoa (P = 0.94, teko ea Fisher's e nepahetseng, mahlakore a mabeli).Liphanele tsohle, n e emela palo ea lisampole tsa menoang tse ikemetseng ka tlhaho. NS, ha e bohlokoa.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Ka mor'a moo, re ile ra hlahloba hore na ecdysone dephosphorylation e bohlokoa bakeng sa ho baka khanyetso ea ho kopana ho tse tšehali. Haholo-holo, tse tšehali tse kopantsoeng le tse tona tse senyehileng ke EPP li ile tsa kopana hape ka makhetlo a phahameng haholo (44.9%) ho feta tse tšehali tse laolang (10.4%) ha li pepesetsoa tse tona tse ling (tse fetotsoeng liphatsa tsa lefutso) (Setšoantšo sa 3c). Re boetse re bone phokotso e kholo ea monono (Setšoantšo sa 3d, ka letsohong le letšehali) le phokotso e nyane palong ea mahe a behetsoeng ke tse tšehali tsena (Setšoantšo sa 3d, bohareng), ha peresente ea mahe a behetsoeng ke tse tšehali (karabelo e 'ngoe e hlahisitsoeng ho tse tšehali ka ho kopana )) e sa ka ea angoa (Setšoantšo sa 3d, ka ho le letona). Ka lebaka la ho totobala ho bonoang ha EPP bakeng sa 3D20E22P, liphetho tsena li bontša hore ts'ebetso ea 3D20E ke EPP e fetisitsoeng nakong ea ho kopana e ka ba le karolo ea bohlokoa ho thibeleng ho amohela ha basali ho kopana ho hong, boitšoaro bo neng bo amahanngoa le phetisetso ea thobalano ea 20E pele. Ka hona, hormone ena e ikhethileng ea banna le eona e ama haholo monono oa basali.
Ka mor'a moo, re bapisitse mesebetsi ea 20E le 3D20E litekong tsa ente ho baroetsana ba hōlileng thobalanong re sebelisa 3D20E e entsoeng ka lik'hemik'hale (Setšoantšo sa 4a–c) le 20E e fumanehang khoebong. Re hlokometse hore 3D20E e ne e sebetsa hantle haholo ho feta 20E ho thibeleng kutloisiso ea basali ho ho nyalana maemong ana ka bobeli (Setšoantšo sa 4d). Haholo-holo, halofo ea boemo ba 'mele ba 3D20E ho LRT (1,066 pg kamora ho entoa khahlanong le 2,022 pg kamora ho nyalana) e bakile karolo ea basali ba sa laoleheng e neng e phahame ka makhetlo a 20 ho feta boemo ba 'mele ba 20E (361 pg kamora ho entoa) lihora tse 24 kamora ho entoa ka bongata bo phahameng ka ho fetisisa ba 18 pg kamora ho nyalana; Tafole ea Lintlha e Atolositsoeng ea 1). Sephetho sena se lumellana le khopolo ea hore phetisetso ea thobalano ea 20E ha e bake linako tse hanyetsanang le ho kopana, 'me ho feta moo e supa 3D20E e le ntlha ea bohlokoa ho netefatseng kamano ea motsoali le ngoana. 3D20E e ne e boetse e sebetsa haholo ho feta 20E litekong tsa ho beha mahe ho basali ba sa nyaloang (Setšoantšo sa 4e), e leng se bontšang hore sekhahla se tloaelehileng sa ho beha mahe seo re se boneng kamora ho khutsisa karolo ea EPP se ne se bakoa ke boteng ba ts'ebetso e setseng ea 3D20E e ntseng e hlahisoa ke mabaka a basali a bakoang ke ho kopana.
(a,b) 3D20E e entsoeng ka lik'hemik'hale ho tloha ho 20E (a) ka phetoho/bokgoni bo phahameng haholo (data e hlahisitsoeng e le karolelano ± sem ho tsoa liketsong tse tharo tse ikemetseng tsa synthesis) (b).c, Mass spectrum (karolo e ka tlase) e ts'oana hantle le ecdysone e fumanoang ho LRT e tšehali e kopantsoeng (karolo e ka holimo).d, Ha e bapisoa le 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Teko e nepahetseng ea Fisher, e mahlakore a mabeli) le 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Teko e nepahetseng ea Fisher, e mahlakore a 2), ha 20E e ne e le holimo haholo ho feta taolo feela ka tekanyo e phahameng (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Teko e nepahetseng ea Fisher, 2-lehlakoreng).e, ente ea 3D20E e bakile sekhahla se phahameng haholo sa ho tsoala ho basali ba sa nyaloang ho feta taolo ea ethanol ea 10% (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Teko e nepahetseng ea Fisher, mahlakore a mabeli), ha 20E e bapisoa le taolo Feela ka tekanyo e phahameng (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Teko e nepahetseng ea Fisher, mahlakore a mabeli).3D20E e bakile sekhahla se phahameng haholo sa ho tsoala ho feta 20E ka tekanyo e phahameng (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Teko e nepahetseng ea Fisher, mahlakore a mabeli).Liphanele tsohle, n e emela palo ea lisampole tsa menoang tse ikemetseng ka tlhaho.NS, ha e bohlokoa.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Lintlha li tsoa ho likopi tse tharo.
Lithutong tse fetileng, re fumane hore phetiso ea thobalano ea lihormone tsa steroid e baka tlhahiso ea MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), e leng liphatsa tsa lefutso tsa basali tse sireletsang basali ba A. gambiae ho tsoa tšoaetsong ea P. falciparum. Litšenyehelo tsa bophelo bo botle tse bakoang ke 13, e leng kokoana-hloko e bolaeang ka ho fetisisa ea malaria ho batho. Ka lebaka la bohlokoa ba MISO ho matla a ho ikatisa a Anopheles libakeng tse atileng haholo ke malaria, re nkile qeto ea ho fumana hore na ke hormone efe ea 3D20E kapa 20E e bakang tlhahiso ea liphatsa tsena. Re fumane hore leha ente ea 20E e baka ka ho khetheha kapa ka matla ho feta li-receptor tse ling tsa lihormone tsa nyutlelie (HR), joalo ka HR3 le HR4, le lipheo tse tloaelehileng tsa steroid tse theohelang tlase, joalo ka liphatsa tsa lefutso tsa yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO e ile ea bakoa ka matla le ho feta ke 3D20E (Setšoantšo sa Lintlha se Atolositsoeng sa 3). Kahoo, phetiso ea thobalano ea hormone ena ea androgenic steroid e bonahala e baka mekhoa e sireletsang basali litšenyehelong tse bakoang ke tšoaetso ea likokoana-hloko. Ho feta moo, 3D20E e ama ka tsela e fapaneng li-isoform ka bobeli tsa E receptor EcR, e susumetsang EcR-A le ho hatella EcR-B, mme e baka ka matla liphatsa tse ling tsa lefutso tse susumetsang ho kopana, ho kenyeletsoa HPX15, e amang tsoalo ea basali. Sena se ka hlalosa ho hloka thari ho hoholo ho bonoang ho basali ba nyalaneng le banna ba khutsisitsoeng ke EPP (Setšoantšo sa 3 sa Lintlha tse Atolositsoeng). Lintlha tsena li bontša boteng ba litsela tse theohelang tse susumetsoang ka ho khetheha ke lihormone tse peli tsa ecdysone tse ka 'nang tsa beha tšebetso e itseng ea bong tlas'a eona.
Ka mor'a moo, re ile ra leka mosebetsi oa liphatsa tsa lefutso tse peli tsa EcK tse khethiloeng mothapong oa rona oa bioinformatics. Ho khutsisa EcK1 kapa EcK2 ho ile ha fella ka lefu le leholo ho banna (Extended Data Fig. 4a), ho fana ka maikutlo a hore ecdysone phosphorylation, kahoo ho se sebetse, ho bohlokoa bakeng sa ho phela. Hobane EcK2 e ne e hlahisoa maemong a holimo ho feta EcK1 mme e fumanoe ho MAG ke proteomics (Setšoantšo sa 2b, c le Tafole e Tlatsetsang ea 2), re netefalitse ts'ebetso ea eona ea ecdysteroid kinase ka ho e kenya ka 20E, e leng se ileng sa fella ka phosphorylation 20E22P (Setšoantšo sa Extended Data Fig. 2).4b). Ha re sebelisa 3D20E e le substrate, re ne re sa khone ho fumana sehlahisoa sa phosphorylated 3D20E22P (Setšoantšo sa Extended Data Fig. 4c), ho fana ka maikutlo a hore 20E ho fapana le 3D20E e ka ba sepheo se khethiloeng sa EcK2.
Ho ya ka tlhahlobo ya rona ya RNA-seq, EcK2 e ne e boetse e hlahiswa haholo ho LRT ya basadi ba baroetsana, moo e neng e tingwa ka mora ho nyalana (Setshwantsho sa 2b). Re netefaditse data ena mme ra fumana hore tlhahiso ya EcK2 ha e a angwa ke ho fepa madi (Setshwantsho sa Extended Data 5a). Ha re atolosa diteko tsa rona tsa pele tsa MS, re fumane hore tlhoro ya 20E22P e ne e amana haufiufi le tlhoro ya 20E (dihora tse 22-26 kamora ho ja madi; Setshwantsho sa Extended Data 5b). Ho kgutsisa EcK2 ho basadi ba baroetsana ho bakile keketseho ya makgetlo a 3 ka karolelano e bapiswang ya 20E ho ya ho 20E22P dihoreng tse 26 kamora ho ja madi (Ditshwantsho tsa Extended Data 2c le 5c), ho tiisa hore EcK2 e boetse e na le phosphorylates 20E ho basadi. Haholoholo, basadi ba baroetsana ba felletsweng ke EcK2 ba ile ba boloka kamohelo e felletseng ya thobalano (Setshwantsho sa Extended Data 5d,e), ho fana ka maikutlo a hore tlhahiso ya basadi ya 20E ha e bake ho hana ho nyalana. linako.Leha ho le jwalo, diphoofolo tsena tse tshehadi di ne di eketsehile haholo ka sekgahla sa ho behela mahe ha di bapiswa le tse laolang, ka ho feta 30% ya diphoofolo tse sa tswalwang tse behelang mahe (Setshwantsho sa Dintlha tse Atolositsweng 5f).Haeba diente tsa Eck2 RNA (dsEcK2) tse nang le marapo a mabedi di ne di entswe kamora ho fepuwa ka madi, ho behela ha tsona ha ho a ka ha etsahala, moo tlhoro ya 20E ka lebaka la ho ja madi e neng e fokotsehile.Ka kakaretso, diphetho tsena di tshehetsa mohlala oo 20E e o hlahisitseng kamora ho anya madi o ka bakang ho behela, empa feela ha thibelo ya ho behela (EcK2 le mohlomong mabaka a mang) e timilwe ke ho behelana.Diente tsa 20E kapa 3D20E ha di a ka tsa thibela tlhahiso ya EcK2 ho diphoofolo tse sa tswalwang (Setshwantsho sa Dintlha tse Atolositsweng 5g), tse bontshang hore mabaka a mang a buella thibelo ya kinase ena.Leha ho le jwalo, maemo a 20E kamora ho fepuwa ka madi a ne a sa lekana ho baka ho se phutholohe ha ho behelana ka thobalano, empa a ile a bakwa ke maemo a hodimo a 3D20E e fetisetswang ka thobalano.
Liphetho tsa rona li fana ka temohisiso ea bohlokoa mabapi le mekhoa e laolang katleho ea ho ikatisa ea A. gambiae. Mohlala o hlahile moo banna ba fetohileng ho hlahisa li-titers tse phahameng tsa 3D20E, ecdysone e fetotsoeng e ikhethileng ea banna e netefatsang botsoali ka ho fokotsa kutloisiso ea basali ho holisana ho eketsehileng. Ka nako e ts'oanang, li-vector tsena tsa malaria li boetse li hlahisitse sistimi e sebetsang ea ho kenya tšebetsong 3D20E ho basali ho arabela phetisong ea thobalano ea EPP e ikhethileng ea banna. Ho ea ka tsebo ea rona, ona ke mohlala oa pele oa sistimi ea lihormone tsa steroid e laoloang ke banna le basali e etsang mosebetsi o ikhethang le oa bohlokoa ho likokoanyana. Mosebetsi oa ecdysone e ikhethileng ea banna o se o nahanoa empa ha oa bontšoa ka ho hlaka. Mohlala, khopolo-taba e sa sireletsoang haholo 18 ke hore mesebetsi ena e ka etsoa ke selelekela sa 20E E1. Ho tsebahala hantle hore ho Drosophila, monandry e bakoa ke phetiso ea thobalano ea li-peptide tse nyane tsa thobalano19,20 tse sebelisanang le li-neuron tse kenyang mokhoa oa ho ikatisa oa basali ka li-receptor tse ikhethileng tsa peptide tsa thobalano21,22. Mosebetsi o mong oa hlokahala ho fumana hore na ho theoha hokae. meketjana ea lipontšo e laoloang ke 3D20E ho tse tšehali tsa A. gambiae le ho fumana hore na meketjana ena e ka bolokoa pakeng tsa menoang le Drosophila.
Ka lebaka la karolo ea bohlokoa ea 3D20E mabapi le tsoalo ea basali le boitšoaro bo hlwailoeng thutong ea rona, litsela tse lebisang ho qaptjoeng le ho kenngoeng ha 3D20E li fana ka menyetla e mecha bakeng sa maano a taolo ea menoang a nakong e tlang, joalo ka ho hlahisa banna ba hlōlisanang ba nyopang maanong a theknoloji ea likokoanyana tse nyopa. Sebelisa bakeng sa ho lokolloa ha naha kapa ho etsisa 3D20E papaling ea virgin. Mosebetsi o ikhethileng oa 3D20E oa banna o kanna oa fetoha ha A. gambiae le mefuta e meng ea Cellia li fumana bokhoni ba ho kopanya peō ea tsona ka har'a li-plug tsa ho kopana, kaha sena se lumella phetiso e sebetsang ea lihormone tse ngata le li-enzyme tse susumetsang lihormone. Ka lehlakoreng le leng, phetoho ea 3D20E e sebelisang monandry e fana ka mokhoa oa hore basali (ka tlhahiso e phahameng ea MISO) ba rate boikoetliso ba bona ba ho ikatisa libakeng tse nang le tšoaetso e phahameng ea malaria, e leng se tlatsetsang ka tsela e sa tobang phetisong ea Plasmodium. Ka lebaka la hore 20E ea basali e bontšitsoe e na le litlamorao tse tebileng ho pholoheng le kholong ea P. falciparum ho menoang ea basali ea Anopheles,24 litsela tsa lihormone tsa steroid tsa banna le tsa basali joale ke likarolo tsa bohlokoa tsa likamano tsa menoang le likokoana-hloko.
Mefuta ea A. gambiae G3 e holisitsoe tlas'a maemo a tloaelehileng a likokoanyana (26-28 °C, mongobo oa 65-80%, nako ea khanya/e lefifi ea lihora tse 12:12). Liboko li ile tsa fepuoa ka lijo tsa tlhapi tse phofshoana (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets le Tetra Pond Sticks ka karolelano ea 7:7:2). Menoang e meholo e ile ea fepuoa ka tharollo ea dextrose ea 10% le mali a motho a beke le beke (likarolo tsa mali tse ithutoang). Menoang e moroetsana e fumanoe ka ho arola bong boemong ba pupal ka mor'a ho hlahloba lipheletso ka microscopy. Tse tona tse jereng transgene ea DsRed li hlalositsoe pejana.
Liteko tsa ho kopanya ka thata li entsoe ho latela melaoana e hlalositsoeng pele. Bakeng sa ho kopanya ka tlhaho, basali ba baroetsana ba matsatsi a 4 ba ile ba bolokoa ka karolelano ea 1:3 le baroetsana ba baholo ba thobalano ka masiu a mabeli. Bakeng sa liteko tseo ho tsona ba batona ba ileng ba entoa ka dsEPP, ho kopanya ka har'a cage ho ile ha tsamaellana le matsatsi a 3-4 kamora ho entoa, ha ts'ebetso ea phosphatase e ne e khutsisoa ka botlalo (Setšoantšo sa Atolositsoeng sa Lintlha 2b).
Lisele tsa menoang, litopo tse setseng (karolo e setseng ea 'mele), kapa 'mele oohle li ile tsa aroloa ka 100% methanol 'me tsa kopanngoa ka beader (li-bead tsa khalase tsa 2 mm, 2,400 rpm, metsotsoana e 90). Bongata ba lisele le bophahamo ba methanol e ne e le ka tsela e latelang: karolo e setseng ea 'mele, 50 ho 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT e tšehali, 25–50 80 µl. Ho ntsha methanol ka har'a mothapo oa bobeli ka bongata bo tšoanang ba methanol. Litšila tsa sele li ile tsa tlosoa ka ho centrifugation. Methanol e tsoang ho metsoako ka bobeli e ile ea kopanngoa 'me ea omisoa tlas'a phallo ea naetrojene, eaba e emisoa hape ka methapo e latelang ea 80% methanol ka metsing: karolo e setseng ea 'mele, 50 µl; MAG le LRT e tšehali, 30 µl.
Disampole di ile tsa sekasekwa hodima sesebelisoa sa ho lekanya boima (ID-X, Thermo Fisher) se hokahantsweng le sesebediswa sa LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl ya sampole e ile ya kenngwa hodima kholomo ya 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) e bolokilweng ho 25 °C. Mekgahlelo e tsamayang bakeng sa LC e ne e le A (metsi, 0.1% formic acid) le B (acetonitrile, 0.1% formic acid). Gradient ya LC e ne e le ka tsela e latelang: 5% B motsotso o le mong, ebe e eketswa ho 100% B metsotsong e 11. Kamora metsotso e 8 ho 100%, leka-lekanya kholomo hape ho 5% B metsotso e 4. Sekgahla sa phallo e ne e le 0.3 ml min-1. Ionization mohloding wa MS e fihlellwa ke electrospray ionization e futhumaditsweng ka mekgwa e metle le e mebe.
Seteishene sa boima se lekanya data ka har'a m/z ho tloha ho 350 ho isa ho 680 ka qeto ea 60,000 ka mokhoa o felletseng oa MS. Lintlha tsa MS/MS li fumanoe ho [M + H]+ (lipheo tsohle), [M - H2O + H]+ (lipheo tsohle), le [M - H]- (lipheo tse nang le phosphorylated). Lintlha tsa MS/MS li sebelisitsoe ho netefatsa thepa ea ecdysone ea lipheo tseo ho neng ho se na maemo a fumanehang bakeng sa tsona. Ho khetholla li-ecdysteroids tse sa reretsoeng, lintlha tsa MS/MS bakeng sa litlhōrō tsohle tsa HPLC tse nang le bongata bo fetang 15% li ile tsa hlahlojoa. Bala ka ho sebelisa li-curve tse tloaelehileng tse entsoeng ho tsoa litekanyetsong tse hloekileng (20E, 3D20E) ho bala bongata bo felletseng kapa li-dilution tsa sampole e le 'ngoe e itseng (lipheo tse ling tsohle) ho bala ho lekana ha tsona le bongata bo fumanoeng ho e tona e le 'ngoe. Bakeng sa 3D20E, tekanyo e entsoe ho sebelisoa kakaretso ea li-adducts tse latelang: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Data e ntšitsoe le ho lekanngoa ho sebelisoa Tracefinder (mofuta oa 4.1).Data ea MS/MS e hlahlobiloe ho sebelisoa Xcalibur (mofuta oa 4.4). MS spectra ea E, 20E le 3D20E e bapisitsoe le maemo a amehang. 3D20E22P e hlahlobiloe ka ho ntšoa ha data ka reagent ea Girard. 20E22P e hlahlobiloe ka karolelano ea m/z.
3D20E22P e hloekisitsoe ho tsoa ho MAG. Tlhoekiso e entsoe ka tekanyo ea tlhahlobo ho sebelisoa chromatograph ea metsi e sebetsang ka mokhoa o phahameng (Acquity, Waters) ka sesebelisoa sa ho lemoha boima ba quadrupole (QDa, Acquity, Waters) tlas'a maemo a tšoanang a LC le tlhahlobo ea HPLC-MS/MS. Pokello ea likaroloana e qalile ha m/z e tsamaellanang le 3D20E22P e fumanoa ka nako e tšoanang ea ho boloka joalokaha ho ne ho boletsoe pele. Bohloeki ba metsoako e ntšitsoeng bo ile ba hlahlojoa ke HPLC-MS/MS joalo ka ha ho hlalositsoe kaholimo.
RNA yohle e ntshitswe dinama tse 10-12 tsa ho ikatisa kapa dikarolong tse ding tsa mmele (tse se nang hlooho) ho sebediswa TRI reagent (Thermo Fisher) ho latela ditaelo tsa moetsi. RNA e ile ya phekolwa ka TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA e ile ya etswa ka ho sebedisa Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ho latela ditaelo tsa moetsi. Di-primer bakeng sa reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) di ile tsa phatlalatswa pele24 kapa tsa etswa ka ho sebedisa Primer-BLAST26, ka kgetho e fuwang dihlahiswa tsa boholo ba 70-150 bp le ho arola di-junctions tsa exon-exon kapa di-primer pair primer tse arohaneng tsa di-exons. Disampole tsa cDNA ho tloha ho di-replicates tse tharo ho isa ho tse nne tsa baeloji di ile tsa hlapollwa ka makgetlo a mane ka metsing bakeng sa RT-qPCR. Palo e entswe ka di-replicates tse 15 µl tse nang le 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), di-primer, le 5 µl ya cDNA e hlapollotsweng. Dikarabelo di ile tsa tsamaiswa ho Sistimi ea PCR ea QuantStudio 6 Pro ea nako ea sebele (Thermo Fisher) le lintlha li ile tsa bokelloa le ho hlahlojoa ho sebelisoa Moralo le Tlhahlobo (mofuta oa 2.4.3). Joalokaha ho bontšitsoe thutong ena, litekanyo tse amanang li ile tsa fetoloa hore e be tsa gene ea ribosomal RpL19 (AGAP004422), eo polelo ea eona e sa kang ea fetoha haholo ka ho fepa mali 27 kapa ho kopana 3.
Boleng ba RNA bo hlahlobiloe ho sebediswa Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Dilaeborari tsa Illumina tse nang le dipheletso tse pedi di ile tsa lokiswa mme tsa tsamaiswa Setsing sa Broad sa MIT le Harvard. Dipalo tsa tatellano di ile tsa tsamaiswa ho latela genome ya A. gambiae (mofuta wa PEST, mofuta wa 4.12) ho sebediswa HISAT2 (mofuta wa 2.0.5) ka diparamitha tsa kamehla. Dipalo tse nang le lintlha tsa boleng ba 'mapa (MAPQ) <30 di ile tsa tloswa ho sebediswa Samtools (mofuta wa 1.3.1). Palo ya dipalo tse badilweng ho dijini e ile ya balwa ho sebediswa htseq-count (mofuta wa 0.9.1) ka diparamitha tsa kamehla. Dipalo tsa dipalo tse tlwaelehileng di ile tsa balwa mme polelo ya dijini e fapaneng ya hlahlojwa ho sebediswa sephutheloana sa DESeq2 (mofuta wa 1.28.1) ho R (mofuta wa 4.0.3).
Bakhethoa ba liphatsa tsa lefutso tse fetolang Ecdysone ba ile ba khetholloa ka ho batla genome ea A. gambiae pele ba sebelisa algorithm ea PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), ba sebelisa boleng ba kamehla Liparamitha tse nang le tatellano e latelang ea protheine ea potso: ho tsoa ho Bombyx mori (Nomoro ea Kamohelo. NP_001038956.1), Musca domestica (Nomoro ea Kamohelo. XP_005182020.1, XP_005175332.1 le XP_011294434.1) le Microplitis demolitor (Nomoro ea Kamohelo. XP_008552646.1 le XP_008552645.1) EcK ho tsoa ho B. mori (Nomoro ea Kamohelo. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Nomoro ea Kamohelo. NP_651202), Apis mellifera (Kamohelo Nomoro. XP_394838) le Acyrthosiphon pisum (Kamohelo Nomoro. XP_001947166); le EPP ho tsoa ho B. mori (Kamohelo Nomoro. XP_001947166) NP_001177919.1 le NP_001243996.1) le EO ea D. melanogaster (Kamohelo Nomoro. NP_572986.1) (mohato oa 1). Ka mor'a moo, filthara e otla ho latela tlhahiso e phahameng ea mRNA (likarolo tse >100/li-exons tsa kilobase ka limilione tse baloang 'mapeng (FPKM) kapa >85%) liseleng tsa ho ikatisa (LRT ea basali kapa MAG) Gambia (mohato oa 2). Ho ntlafatsa ho hlaka, re khethile li-enzyme tse ka khethoang tse boetseng li hlahisoa liseleng tsa ho ikatisa tsa A. albimanus, mofuta oa anopheles o sa etseng kapa ho fetisetsa ecdysone nakong ea ho ikatisa. Liphatsa tsa lefutso tse ka khethoang li sefiloe ho latela tlhahiso e tlase (<100 FPKM kapa <85th percentile) liseleng tsa ho ikatisa tsa A. albimanus (mohato oa 3). Jwalo ka sefe ea ho qetela (mohato oa 4), liphatsa tsa lefutso tse ka khethoang li hloka ho khotsofatsa bonyane e 'ngoe ea tse latelang: (1) e ntlafalitsoe haholo kamora ho ikatisa (P < 0.05) ho latela tlhahlobo ea liphatsa tsa lefutso tse hlahisitsoeng ka tsela e fapaneng le (2) liseleng tse sa ikatiseng (< 85 % kapa <100 FPKM).
Re fetotse mekhoa e hlalositsoeng pele 28,29,30 ho fihlela ho ngoloa ha isotopic ea 'mele oohle. Ka bokhutšoanyane, mofuta oa Saccharomyces cerevisiae oa mofuta oa II (YSC2, Sigma) o ile oa lekoa ka har'a tomoso ea naetrojene (BD Difco, DF0335) e nang le (wt/vol) 2% glucose (G7528, Sigma), 1.7% amino acid-free le ammonium sulfate. culture medium) le 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) e le mohloli o le mong oa naetrojene. Tomoso e ile ea fumanoa ka centrifugation 'me liboko tsa monoang li ile tsa feptjoa ad libitum ho fihlela li-pupation. Tlatsetso ka lijo tsa tlhapi (0.5 mg ka liboko tse 300) ho thibela lefu la bone la linaleli. Ke tse tšehali feela tse ileng tsa sebelisoa litekong tsa ho nyalana le tse tona tse sa ngoloang ho sekaseka proteome e tona e fetisitsoeng nakong ea ho nyalana.
Li-rooster tse tšehali tse nang le matšoao a 15N tse lilemo li 4-6 li ile tsa qobelloa ho kopana le tse tona tse sa kang tsa kopana le tsona tse lilemo li lekana. Ho kopana ho atlehileng ho ile ha netefatsoa ka ho lemoha li-plug tsa ho kopana tlas'a microscopy ea epifluorescence. Ka matla a 3, 12, le 24 hpm, atria ea tse tšehali tse 45-55 tse kopantsoeng e ile ea aroloa ka har'a 50 µl ea ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) 'me ea etsoa homogenized ka pestle. Homogenate e ile ea kenngoa centrifuge 'me supernatant e kopantsoe le 50 µl ea 0.1% RapiGest (186001860, Waters) ka har'a 50 mM ammonium bicarbonate. Supernatant le pellet ho tsoa sampole ka 'ngoe li ile tsa hoamisoa leqhoeng le omileng 'me tsa romeloa bosiu laboratoring ea MacCoss Univesithing ea Washington, moo ho lokisetsoang sampole bakeng sa LC-MS/MS ho ileng ha phethoa. Pheta pellet hape ka 50 µl ea 0.1% RapiGest ka 50 mM. ammonium bicarbonate le sonicate ka bateng ea metsi. Bongata ba protheine ea pellet le supernatant bo lekantsoe ka tlhahlobo ea BCA, lisampole li fokotsoe ka 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), e kopantsoeng le 15 mM iodoacetamide (Sigma) 'me ea kenngoa mochesong oa 37 °C (1:0 50) ka hora e le' ngoe ka trypsinization: trypsin: substrate ratio). RapiGest e ile ea hlahlojoa ka ho eketsoa ha 200 mM HCl, ea lateloa ke ho kenngoa mochesong oa 37 °C metsotso e 45 le ho kenngoa ka centrifugation ka 14,000 rpm metsotso e 10 ho 4 °C ho tlosa lithōle. Lisampole li ile tsa hlatsuoa ka ho ntšoa ha dual-mode solid-phase extraction (Oasis MCX cartridges, Waters) 'me tsa emisoa hape ka 0.1% formic acid bakeng sa bongata ba ho qetela ba protheine ba 0.33 µg µl-1. Li-proteome tsa MAG tse sa ngoloang li ile tsa hlahlojoa ka mokhoa o tšoanang ho tsoa ho virgin. tse tona. Likopi tse peli tsa tlhahlobo li ile tsa hlahlojoa bakeng sa sampole ka 'ngoe. Ka mor'a moo, 1 µg ea e 'ngoe le e 'ngoe e ile ea hlahlojoa ho sebelisoa kholomo ea silica e kopantsoeng ea 25-cm 75-μm e nang le leraba la frit la silica Kasil1 (PQ) la 4-cm le tletseng resin ea Jupiter C12 reversed-phase (Phenomenex) le chromatography ea metsi ea metsotso e 180. Digest tsa sampole – MS/MS e ne e tsamaisoa ho Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) ka nanoACQUITY UPLC System (Waters). Lintlha tse amanang le ho fumana data tse hlahisitsoeng bakeng sa ho matha ka 'ngoe li fetotsoe ho sebopeho sa mzML ho sebelisoa Proteowizard (mofuta oa 3.0.20287) le ho sebelisoa Comet31 (mofuta oa 3.2) khahlanong le database ea FASTA e nang le tatellano ea protheine ho tsoa ho Anopheles gambiae (mofuta oa VectorBase 54), Anopheles coluzzi Patlo e entsoe ho Mali-NIH (mofuta oa VectorBase 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Hlakubele 2021), A. gambiae RNA-seq, le liphetolelo tse tharo tsa litšila tse tsejoang tsa batho. Li-FDR tse tsamaellanang le 'mapa oa peptide li ile tsa fumanoa ho sebelisoa Percolator32 (mofuta oa 3.05) ka moeli oa 0.01, 'me li-peptide li ile tsa bokelloa ho ba boitsebiso ba protheine ho sebelisoa parsimony ea protheine ho Limelight33 (mofuta wa 2.2.0). Bongata ba protheine bo amanang bo hakantswe ho sebediswa normalized spectral abundance factor (NSAF) e balwang bakeng sa protheine ka nngwe ho lebelo ka leng jwalo ka ha ho hlalositswe pele. NSAF mabapi le protheine ka nngwe e ne e lekantswe ho pholletsa le disampole ho tswa ho dikopi tse pedi tse fapaneng tsa baeloji. 15N laiboleng e ile ya pata proteome ya tshehadi ka katleho, leha palo e nyane ya protheine e sa ngolwang e ne e ka fumanwa ho tswa ho di-virgin tse ngotsweng. Re tlalehile ho fumanwa ha phokotso ya protheine ya banna (1-5 spectra) disampoleng tse tala tsa basadi feela mathateng a botekgeniki, moo disampole tse tala di neng di tsamaiswa kamora disampole tsa banna/ho nyalana, ka lebaka la HPLC "ho jara". Diprotheine tse fumanwang ka dinako tse ding e le 'ditshila' ho tswa ho di-virgin tse ngotsweng di thathamisitswe ho Tafole e Tlatsetsang ya 1.
Li-peptide tse peli tsa antigenic, QTTDRVAPAPDQQQ (ka hare ho isotype PA) le MESGTTTPSGDSEQ (ka hare ho isotype PA le PB) ho Genscript. Li-peptide tsena tse peli li ile tsa kopanngoa, eaba li kopanngoa le protheine ea carrier KLH 'me tsa kenngoa mebutlanyana ea New Zealand. Mebutlanyana e ile ea etsoa sehlabelo ka mor'a ente ea bone, 'me IgG eohle e ile ea aroloa ka ho hloekisoa ha affinity. IgG ho tsoa ho mmutla o ikhethileng ka ho fetisisa oa EPP e ile ea sebelisoa bakeng sa ho hlakola ho eketsehileng bophirima.
Bakeng sa di-blot tsa western, MAG (n = 10, moo n e emelang palo ya disampole tsa menoang tse ikemetseng ka tlhaho) le LRT e tshehadi (n = 30) ho tswa ho banna ba baroetsana ba matsatsi a 4 le basadi ba baroetsana kapa ba qobelletsweng ho kopana (<10 kamora ho kopana), Protein extraction buffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × protease inhibitor cocktail (Roche)) e ile ya eketswa ka thoko. Disampole di ile tsa fetolwa hang ka mora ho kgaolwa ka beader (di-bead tsa khalase tsa 2 mm, 2,400 rpm, 90 sec). Ditshila tse sa qhibiliheng di ile tsa tloswa ka ho centrifugation ho 20,000 g ho 4 °C. Diprotheine di ile tsa lekanngwa ka Bradford assay (Bio-Rad). Yaba, 20 µg ya protheine ya MAG, 40 µg ya protheine ya LRT, le 20 µg ya protheine e setseng e ngata. Li ile tsa fokotsoa 'me tsa aroloa ka 10% Bis-Tris NuPAGE ho sebelisoa MOPS buffer. Liprotheine li ile tsa fetisetsoa ho polyvinylidene fluoride membranes ho sebelisoa sistimi ea phetisetso ea iBlot2 (Thermo Fisher). Li-membrane li ile tsa hlatsuoa habeli ka 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 ho PBS) eaba lia koaloa ka Odyssey blocking buffer (Li-Cor) ka hora e le 'ngoe ho 22°C. Li-membrane li ile tsa sisinngoa bosiu ho 4 °C ka antibody ea mantlha ea rabbit anti-EPP polyclonal (1:700 ho blocking buffer) le antibody ea mantlha ea rat anti-actin monoclonal MAC237 (Abeam; 1:4,000). Li-membrane li ile tsa hlatsuoa ka PBS-T ebe li kenngoa ka li-antibodies tsa bobeli (tonkey anti-rabbit 800CW le goat anti-rat 680LT (Li-Cor), ka bobeli li 1:20,000) ka blocking buffer e nang le 0.01% SDS le 0.2% Tween -20 ka hora e le 'ngoe mochesong oa 22 °C. Lisele li hlatsoitsoe ka PBS-T 'me li nkiloe setšoantšo ka sekene sa Odyssey CLx. Litšoantšo li ile tsa bokelloa le ho sebetsoa ho Image Studio (mofuta oa 5.2). Sehlopha se itseng se tsamaellanang le isoform ea EPP-RA (82 kDa) ha sea ka sa fumanoa.
Libaka tsa ho ngola khoutu tsa EPP (joalo ka isoform AGAP002463-RB tse nang le histidine phosphatase domain, NCBI conserved domain search 34) le EcK2 (AGAP002181) li ile tsa kopanngoa ho pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); Li-primer li thathamisitsoe ho Tafole ea Lintlha tse Atolositsoeng ea 2. Lihokelo tse robeli tsa GS4 (tse kopaneng) li ile tsa kenngoa pele ho tag ea C-terminal 6xHis ea pET-21a(+)-EcK2. Liprotheine tse kopantsoeng li ile tsa hlahisoa ho sebelisoa karabelo ea protheine ea E. coli e se nang lisele ea NEBEExpress (New England BioLabs). Liprotheine tse kopantsoeng li ile tsa hloekisoa ho sebelisoa likholomo tsa spin tsa NEBEExpress Ni (New England BioLabs). Protheine ea taolo ea Dihydrofolate reductase (DHFR) e hlahisitsoe ho sebelisoa template ea DNA ho tsoa ho NEBEExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Liprotheine li ile tsa bolokoa ka har'a glycerol ea 50% ho PBS ho -20 °C ho fihlela likhoeli tse 3.
Tšebetso ea phosphate ea EPP le li-extract tsa lisele e lekantsoe ho sebelisoa 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Buffer ea karabelo e ne e na le 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, le 1 mM DTT. Linama li ile tsa hokahanngoa ka har'a buffer ea karabelo 'me litšila tsa sele li ile tsa tlosoa ka centrifugation. Qala karabelo ka ho eketsa enzyme kapa tissue extract ho buffer ea karabelo e nang le 2.5 mg ml-1 pNPP. Motsoako oa karabelo o ile oa beoa mochesong oa kamore lefifing, 'me palo ea pNP e fetotsoeng ho tloha pNPP e ile ea lekanngoa ka ho lekanya ho monya ha 405 nm ka linako tse fapaneng.
Bakeng sa ts'ebetso ea EcK ea in vitro, protheine e ile ea kenngoa ka 0.2 mg 20E kapa 3D20E ho 200 µl buffer (pH 7.5) e nang le 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP le 10 mM MgCl2 ka lihora tse 2 ho 27 °C. Karabelo e ile ea emisoa ka ho eketsa 800 µl methanol, eaba e pholile ho -20 °C ka hora e le 'ngoe, ebe e kenngoa ka centrifuge ho 20,000 g ka metsotso e 10 ho 4 °C. Supernatant e ile ea hlahlojoa ke HPLC-MS/MS. Ho futhumatsa le ho thibela liprotheine tse sebelisitsoeng sehlopheng sa taolo, liprotheine li ile tsa kenngoa ka 50% glycerol ho PBS ka metsotso e 20 ho 95 °C.
Bakeng sa ts'ebetso ea EPP ea in vitro, protheine e ile ea kenngoa ka 3D20E22P (e lekanang le bongata bo fumanoeng lipara tse 18 tsa MAG, e hloekisitsoeng ke HPLC-MS/MS) ka har'a buffer ea 100 µl (pH 7.5) e nang le 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, le 1 mM DTT ka lihora tse 3 ho 27 °C. Karabelo e ile ea emisoa ka ho eketsa 400 µl methanol 'me ea pholisoa ho -20 °C ka hora e le' ngoe, eaba e kenngoa ka centrifuge ho 20,000 g ka metsotso e 10 ho 4 °C. Supernatant e ile ea hlahlojoa ke HPLC-MS/MS.
Dikarolo tsa PCR bakeng sa EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) le EcK2 (556 bp) di ile tsa hodiswa ho tswa ho cDNA e lokisitsweng ho tswa ho ditopo tsa menoang tse se nang dihlooho tsa bong bo fapaneng. Karolo ya PCR ya taolo ya eGFP (495 bp) e ile ya hodiswa ho tswa ho pCR2.1-eGFP e hlalositsweng pele; Li-primer tsa PCR li thathamisitsoe ho Tafole ea Lintlha tse Atolositsoeng ea 2. Karolo ea PCR e kentsoe lipakeng tsa li-promoter tsa T7 tse fetotsoeng ho plasmid ea pL4440. Meaho ea plasmid e fumanoe ho tsoa ho NEB 5-α competent E. coli (New England Biolabs) 'me ea netefatsoa ka tatellano ea DNA pele e sebelisoa (sheba Lintlha tse Eketsehileng tsa 1 bakeng sa tatellano ea ho kenya). Li-primer tse tsamaellanang le promoter ea T7 (Tafole ea Lintlha e Atolositsoeng ea 2) li sebelisitsoe ho eketsa kenyelletso ho tsoa ho plasmid e thehiloeng ho pL4440. Boholo ba sehlahisoa sa PCR bo tiisitsoe ke agarose gel electrophoresis.dsRNA e ngotsoe ho tsoa ho litempele tsa PCR ho sebelisoa Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) 'me ea hloekisoa ho latela litaelo tsa moetsi ka liphetoho tse hlalositsoeng pele.
Bakeng sa ente ea dsRNA, 1,380 ng ea dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) e ile ea entoa ka tekanyo ea 10 ng nl-1 ka sefubeng sa banna kapa basali ba baholo (Nanoject III, Drummond) ka letsatsi le le leng kamora ho koaleha ha lisele. Maemo a ho theoha ha liphatsa tsa lefutso a ile a fumanoa bonyane ka likopi tse tharo tsa baeloji ka ho ntšoa ha RNA, ho hlophisoa ha cDNA, le RT-qPCR. Bakeng sa ente ea ecdysone, basali ba nang le banana ba lilemo li 4 kapa ba nang le banana ba lilemo li 6 ba fepuoang mali ba ile ba entoa ka 0.13, 0.21, kapa 0.63 µg ea 20E kapa 3D20E (Nanoject III, Drummond) ka tekanyo ea 1.3, 2.1, ka ho latellana, ho latela moralo oa liteko kapa 6.3 ng nl-1. Kenya 100 nl ea 10% (vol/vol) ethanol ka metsing; 100 nl ea 3D20E22P ka ethanol ea 10% (e lekanang le 75% ea bongata bo fumanoeng para ea MAG). Menoang e ile ea abeloa sehlopha se entetsoeng ka mokhoa o sa reroang.
Bakeng sa liteko tsa ho behela mahe, tse tšehali tse nang le matsatsi a 3 li ne li feptjoa maling a batho ka kotloloho. Tlosa menoang e fepiloeng hanyane kapa e sa fepjoang. Ho latela kalafo, tse tšehali li ne li beoa ka likoping tse arohaneng tsa ho behela mahe ka masiu a mane bonyane lihora tse 48 kamora lijo tsa mali. Mahe a ne a baloa tlas'a stereoscope (Stemi 508, Zeiss); bakeng sa tse tšehali tse ileng tsa behela mahe, mahe a ileng a qhotsoa ho ba liboko a ne a nkoa a nonne.
Bakeng sa liteko tsa ho nyalana, tse tšehali li ile tsa lumelloa bonyane matsatsi a 2 ho latela kalafo ho hlahisa khanyetso ho ho nyalana, 'me tse tona tse tšoanang le tsa mofuta oa hlaha li ile tsa kenngoa ka har'a lesaka le le leng. Masiu a mabeli hamorao, li-vesicle tse tšehali tse nontšitsoeng li ile tsa aroloa 'me DNA ea genomic ea lokolloa ka ho qhibiliha le ho soasoa ka har'a buffer e nang le 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, le 25 mM NaCl (pH 8.2). Lisampole li ile tsa kenngoa ka Proteinase K (0.86 µg µl-1) metsotso e 15 mochesong oa 55 °C, tsa lateloa ke metsotso e 10 mochesong oa 95 °C. Litokisetso tsa DNA tsa genomic tse tala li ile tsa hlapolloa ka makhetlo a 10 'me tsa hlahlojoa ke qPCR ea tatellano ea chromosome ea Y; li-primer li thathamisitsoe ho Tafole e Atolositsoeng ea Lintlha 2. Ho ba sieo ha tatellano ea chromosome ea Y ho bontša hore ha ho na ho nyalana.
Bakeng sa liteko tsa ho kopanya hape, tse tšehali tse qobelloang li ile tsa hlahlojoa bakeng sa boteng ba li-plug tsa ho kopanya ho netefatsa boemo ba ho kopanya 'me tsa lumella matsatsi a 2 ho ba le ho se khone ho kopanya ha tse tona li le sieo, joalo ka ha ho hlalositsoe pele 36. Tse tona tse jereng peo ea DsRed transgenic li ile tsa kenngoa ka har'a lihoko tsa tse tšehali. Masiu a mabeli hamorao, li-vesicle tse nontšang li ile tsa aroloa ho tse tšehali, 'me DNA ea genomic ea lokisoa joalo ka ha ho hlalositsoe kaholimo 'me ea hlahlojoa ke qPCR ea transgene ea DsRed; li-primer li thathamisitsoe ho Tafole ea Lintlha tse Atolositsoeng ea 2. Ho ba sieo ha transgene ea DsRed ho bontšitse hore ha ho na ho kopanya hape ho etsahetseng.
3D20E e entsoe joalo ka ha ho hlalositsoe pele 37. Ka bokhutšoanyane, 10 mg ea 20E (Sigma-Aldrich) e ile ea qhibilihisoa ka har'a 10 ml ea metsi, e lateloa ke ho eketsoa ha 30 mg ea platinum black (ka mokhoa oa phofo, Sigma-Aldrich). Molapo o bonolo oa O2 o ile oa tšeloa ka mokhoa o tsoelang pele ka har'a motsoako oa karabelo, o ileng oa hlohlelletsoa mochesong oa kamore. Kamora lihora tse 6, 30 mL ea methanol e ile ea eketsoa ho emisa karabelo. Motsoako o ile oa centrifugetsoa ho tlosa likaroloana tsa catalyst. Supernatant e ile ea fetoloa mouoane hore e ome ka har'a vacuo mochesong oa kamore. Sehlahisoa sa karabelo e omisitsoeng se ile sa qhibilihisoa ka 10% ethanol le methanol bakeng sa ente bakeng sa tlhahlobo ea HPLC-MS/MS. Sekhahla sa phetoho (ho tloha ho 20E ho ea ho 3D20E) e ne e le hoo e ka bang 97% (Setšoantšo sa 4b), 'me palo ea MS ea 3D20E e entsoeng e tsamaellana le e fumanoeng ho basali ba kopantsoeng (Setšoantšo sa 4c).
Tšōmo ena e na le lintlha tse tobileng tsa liteko tsa lipalo-palo tse entsoeng. GraphPad (mofuta oa 9.0) e sebelisitsoe ho etsa tlhahlobo e nepahetseng ea Fisher, tlhahlobo ea Mantel-Cox, le teko ea t ea Seithuti. Liteko tsa Cochran-Mantel-Haenszel li entsoe ho sebelisoa sengoloa sa R ​​se ikhethileng (se fumanehang ho https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Kabo ea data e ile ea lekoa bakeng sa ho ba le maemo a tloaelehileng ho sebelisoa teko ea Shapiro-Wilk ka moeli oa bohlokoa oa 0.05. Ha data e hloleha tekong ea ho ba le maemo a tloaelehileng, ho ile ha etsoa teko ea Mann-Whitney. Lintlha tsa ho pholoha li ile tsa hlahlojoa ho sebelisoa teko ea Mantel-Cox. Sephutheloana sa DESeq2 (mofuta oa 1.28.1) se ile sa sebelisoa ho etsa tlhahlobo ea phapang ea polelo ea RNA-seq ea boemo ba liphatsa tsa lefutso. Bare e otlolohileng ho grafo e emela bohareng. Boleng ba bohlokoa ba P = 0.05 bo ile ba sebelisoa e le moeli oa liteko tsohle.
Bakeng sa tlhahisoleseding e batsi mabapi le moralo oa thuto, sheba kakaretso ea Tlaleho ea Lipatlisiso tsa Tlhaho e hokahaneng le sengoloa sena.
Lintlha tsa proteomic tsa MS li kentsoe ho ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ka PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ka sesupo sa sete ea data PXD032157.
Sete ea data ea RNA-seq e kentsoe Laeboraring e Felletseng ea Gene Expression (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) tlas'a rekoto ea serial GSE198665.
Disete tse ding tsa data tse hlahisitsweng le/kapa tse sekasekilweng nakong ya phuputso ya hajwale di ka fumanwa ho bangodi ba tsamaellanang ha ho kopuwa ka tsela e utlwahalang. Sengoloa sena se fana ka data ya mohlodi.
De Loof, A. Ecdysteroids: Di-steroid tsa thobalano tsa dikokonyana tse hlokomolohuweng? Banna: Lebokose le Letšo. Saense ya Dikokonyana.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone le ntshetsopele ya mahe a diphoofolo ho Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).